亚慢性阿维菌素中毒对王鸽脑神经递质影响机制的研究

【摘要】阿维菌素(avermectin,AVM)是一种具有抗寄生虫活性的广谱抗生素,在农牧业生产中被广泛应用于驱杀农业害虫与家畜体内外的寄生虫,因此,AVM在环境中的蓄积也随之增多。过量摄入可造成人和动物严重的神经系统损害,其毒性作用机制日益受到研究者们的关注。鸽子是用于监测生态环境变化的首选生物之一,故本课题以王鸽为研究对象,建立王鸽亚慢性中毒模型,观察了王鸽AVM中毒的临床症状、病理组织学结构,检测了王鸽脑组织中氨基酸类神经递质含量及DNA甲基化水平、氨基酸类神经递质受体、炎症因子、甲基转移酶和去甲基化酶基因mRNA的表达情况,探讨AVM中毒对王鸽脑组织的影响及其毒性机制,为进一步研究AVM对鸟类的影响提供可靠的数据资料,并为保护生态环境和促进畜牧业发展提供科学参考。将2月龄健康美国王鸽96只,随机分为4组,每组24只,雌雄各半。试验王鸽自由采食和饮水,采用阶梯式笼养方式,严格按照王鸽的饲养管理标准进行饲养。染毒方式采用给王鸽饲喂含有不同剂量AVM的日粮(对照组饲喂不含AVM的全价日粮、低剂量组20mg/(kg-diet)、中剂量组40mg/(kg-diet)、高剂量组60mg/(kg-diet)的方法染毒,复制王鸽亚慢性AVM中毒模型。在染毒后的第30d、60d、90d分别剖杀试验王鸽,仔细分离王鸽的脑组织,留取大脑、小脑、视叶组织标本,用于病理学观察、神经递质及炎症因子等指标的检测。应用高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography,HPLC)检测脑组织中Y-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid,GABA)、甘氨酸(Glycine,Gly)、谷氨酸(Glutamicacid,Glu)、天冬氨酸(Asparticacid,Asp)四种氨基酸类神经递质含量及DNA甲基化水平,通过实时荧光定量PCR法检测脑组织中氨基酸类神经递质受体γ-氨基丁酸A受体(gamma-aminobutyricacidAreceptor,GABAAR)、γ-氨基丁酸B受体(gamma-aminobutyricacidBreceptor,GABABR)、N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-Aspartate,NMDA)受体亚型NR1、NR2A、NR2B受体、炎症因子包括诱导型一氧化氮合酶(cytokineinducible-NOS,iNOS),核转录因子-κB(NuclearfactorκB,NF-κB),前列腺素E合酶(prostaglandinEsynthase,PGES),甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMT)DNMT1、DNMT3A、DNMT3和去甲基化酶(demethylase,MBD2)的基因mRNA表达。研究结果如下：1.病理学观察表明,王鸽脑组织HE染色发现,与对照组相比,AVM染毒组的大脑、小脑和视叶组织的结构混乱,大脑组织主要表现为：神经元周围间隙及小血管间隙增宽；神经纤维走行紊乱,神经元肿胀,细胞质增加,神经元空泡化以及胞核浓缩。小脑、视叶组织与大脑表现相似。此外,小脑还出现了浦肯野细胞质空泡化,颗粒层细胞松散,颗粒细胞的细胞核的浓缩或破裂,结构混乱,松散,神经纤维间的间隙增大。超微结构的观察表明：与对照组相比,AVM染毒可导致大脑、小脑和视叶组织的超微结构破坏。大脑组织主要表现为核膜不完整;在核膜或核孔分布着浓缩不均匀的染色质；线粒体肿胀,线粒体嵴破坏,溶解和空化。视叶和小脑组织的超微结构改变与大脑相似。证实AVM暴露不仅引起王鸽神经系统损害的临床症状,而且可导致鸽脑的组织学改变,鸽脑多部位的神经细胞超微结构损害明显。2.优化了王鸽脑组织中氨基酸类神经递质含量及DNA甲基化水平的高效液相色谱检测方法。氨基酸含量检测优化条件为：色谱柱：DiamonsilC18(4.6mm×200mm,5μm);检测波长：350nm；流动相：A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液(NaAc,pH=5.8),B为乙腈-水(1：1,V/V),梯度洗脱程序B由初始时的13%经10min至48%,18min至85%；流速：1.0ml/min;柱温为20℃；取10μ1进样分析。DNA甲基化水平检测优化色谱条件如下：色谱柱为DIKMASpursilC18-EP(250mm×4.6mm5μm);紫外检测波长280nm；流动相是甲醇和0.05mo1/L磷酸二氢钾(10：90,V/V,pH3.5)；流速为1.0mL/min,上样量20μL。均采用外标定量,紫外检测。后续结果表明本方法快速、准确、简单、灵敏度高、重复性好。3.氨基酸类神经递质含量检测结果表明AVM染毒后四种氨基酸神经递质Asp、Glu、Gly、GABA含量均增高(P<0.05),染毒组中GABAAR、GABABR、NR1、NR2A、NR2B基因mRNA表达量与对照组比较也显著升高(P<0.05),随着染毒剂量的增加,Asp、Glu、Gly、GABA含量均呈逐渐增高趋势(P<0.05),GABAAR、GABABR、NR1、NR2A、NR2B基因表达量也具有相同的变化趋势。大脑、小脑、视叶组织变化趋势相似,其中大脑组织中氨基酸类神经递质含量及其受体基因表达量升高最明显。这种改变与AVM暴露的时间与剂量具有一定的量效关系。表明AVM暴露造成王鸽脑组织四种氨基酸类神经递质含量增高,其受体基因的mRNA表达增强,可能是AVM的神经毒性的机制之一。4.AVM染毒后导致王鸽脑组织DNA总甲基化水平降低,甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA表达量降低和去甲基化酶MBD2基因mRNA表达量升高,与对照组比较具有统计学意义(P<0.05),大脑、小脑、视叶具有相同的变化趋势。随着染毒剂量的增加DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA表达量呈逐渐降低趋势(P<0.05),MBD2基因mRNA表达量呈逐渐增高趋势(P<0.05)。这种改变也与AVM暴露的时间与剂量具有一定的效应关系。表明AVM中毒引起王鸽脑组织损伤与DNA总甲基化水平降低有关。5.AVM染毒后对大脑、小脑、视叶中iNOS、NF-κB、PGES基因的mRNA表达量的影响相似,在30d,其基因的mRNA表达量以剂量依赖的方式逐渐增加(P<0.05),但是,在60d、90d时间点,其基因的1mRNA表达量显示的是先上升然后下降的趋势(P<0.05)。在小脑和视叶,这些炎症因子的表达量表现出类似的趋势。但不同脑区在不同的时间点其变化的水平有所不同。提示炎症基因iNOS、NF-κB、PGE参与了AVM致脑组织毒性损害过程。综上所述,AVM染毒后大脑、小脑、视叶组织均受到损伤,这种影响最显著的是大脑,表明大脑可能是AVM中毒损伤的主要部位之一。本试验从病理形态学的光镜和电镜观察,脑组织氨基酸类神经递质含量及相关受体基因的表达,炎症因子基因表达,DNA甲基化水平及其甲基转移酶和去甲基化酶的基因表达等指标的检测,探讨并丰富了AVM的神经毒性作用机制。
【作者】陈立杰；
【导师】李术；
【作者基本信息】东北农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】AVM；氨基酸类神经递质；DNA甲基化；王鸽；炎症因子；脑；

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