半乳糖化胆固醇配体脂质体材料的酶促构建及其肝靶向性研究

【摘要】目的：去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR),又称半乳糖受体,是单一表达在肝实质细胞膜上的特异性受体。ASGPR可特异性识别并结合含半乳糖残基或乙酰氨基半乳糖残基的寡糖蛋白或寡糖,并且与之相结合,所形成的受体-配基复合物发生微观簇集,随后内陷,复合物被细胞内吞进入溶酶体,释放出药物。ASGPR是一种高效的内吞受体,且专一存在于肝实质细胞表面,因此ASGPR成为肝脏定向转移的最佳受体,为肝癌的治疗、肝脏基因的定向表达和肝功能检测提供了良好的研究途径。利用ASGPR的生理学特性,可设计一种新型的半乳糖配体分子载体材料,用于装载药物,选择性提高肝实质细胞内的药物浓度、延长作用于肝部位药物的时效、同时减少给药剂量、降低药物毒性。因此,半乳糖配体分子载体材料为药物肝靶向提供了很好的研究思路。非水相酶催化是一种绿色环保的生物催化合成方法。自从研究者发现脂肪酶在有机溶剂中同样具有催化活性后,大大拓展了酶的应用领域。利用酶催化合成医用材料,不仅节能环保,而且极大提高产品的安全性,是一种具有潜力的合成方法。脂质体是一种由磷脂和胆固醇等双分子层构成的具有水相内核的封闭囊泡,具有良好的生理相容性,可提高脂溶性药物的水溶性,改变药物体内分布规律,提高药物的疗效和治疗指数,是一种理想的药物载体。脂质体外层偶联靶向配体分子,能进一步提高药物的靶向性。本课题根据以上三方面的研究内容,旨在设计一种新型半乳糖配体分子,采用酶促法合成,修饰于脂质体表面,制备半乳糖配体靶向脂质体;通过体内药代动力学研究与体外分子生物学研究,验证其对肝脏部位的靶向性。方法：1设计并酶促合成半乳糖配体分子：硬脂酸半乳糖酯(GAL-C18);利用硅胶色谱柱分离纯化产物；通过MS、NMR鉴定化学结构；通过单因素考察研究了各因素对酶促反应的影响规律。2设计并酶促合成(5-Cholesten-3b-yl)vinylDecanedioicacid(CHS-SE);利用重结晶法分离纯化产物；建立CHS-SE含量的高效液相分析方法；利用MS、NMR鉴定化学结构；通过单因素考察研究了各因素对酶促反应的影响规律；利用效应面法设计优化反应参数。3设计酶促合成(5-Cholesten-3b-yl)[(4-O-b-D-galactopyranosyl)D-Glucitol-6]Decanedioicacid(CHS-SE-LA);利用硅胶色谱柱法分离纯化产物；建立CHS-SE-LA含量的HPLC分析方法；利用MS、NMR鉴定化学结构；通过单因素考察研究了各因素对酶促反应的影响规律；利用效应面法设计优化反应参数。4以DOC为模型药物制备DOC普通脂质体和DOC半乳糖配体脂质体；利用HPLC方法测定脂质体中DOC含量；以回收率和分离度为指标比较了两种包封率测定方法；以外观、粒径、Zeta电位、包封率为指标考察两种脂质体制备方法；利用正交实验优化脂质体制备方法。5以SD大鼠为动物模型,考察普通脂质体与半乳糖配体脂质体在体内的药代动力学特征；通过HPLC法测定血浆中DOC含量；利用甲基叔丁基醚萃取法分离出血浆中的DOC；采用加炔诺酮内标物法计算血药浓度；通过DAS2.0软件分析药动学参数。6制备荧光标记的普通脂质体和含不同类型配体分子的半乳糖配体脂质体；利用HepG2细胞考察不同脂质体与肝实质细胞的结合率差异,研究配体脂质体的靶向规律。成果：1通过酶促法合成了硬脂酸半乳糖酯,通过MS、NMR鉴定为目标产物,证明反应位点只发生在半乳糖C-6位；通过单因素考察了酶的种类、加酶量、反应介质、反应温度、硬脂酸乙烯酯与半乳糖的摩尔比、反应时间对酶促酯化的影响,得出最佳反应条件为：以Novozym435脂肪酶作催化剂,底物摩尔比为1：4(半乳糖：硬脂酸乙烯酯),反应介质DMSO:THF(1:3),55℃反应8h,酯化率达75%以上。2通过酶促法两步合成CHS-SE-LA。第一步,将胆固醇与癸二酸二乙烯酯酶促合成,生成(5-Cholesten-3b-yl)vinylDecanedioicacid(CHS-SE)。合成产物采用重结晶法分离纯化,该方法简便、快捷,产物纯度可达95%以上；纯化产物经NS、NMR进行结构鉴定,证明产物为目标产物；建立了反应体系中CHS-SE含量的HPLC分析方法,经线性、精密度、适用性和专属性考察,证明此方法稳定、可靠、专属性好；通过对反应溶剂和酶的种类的筛选,得出最佳反应溶剂和酶为：异辛烷和RCL酶；通过对反应时间、反应温度、底物摩尔比、加酶量、酰基供体的种类单因素考察,确定反应时间(t),加酶量(En)、底物摩尔比(Sr)对酶促反应有显著影响；在此基础上,利用效应面法优法反应条件,得出最佳工艺为：t,11.47h;Sr,8.94;En,7.7mg/mL。通过验证实验,在此工艺条件下,最大产率可达92%以上。3将第一步的产物CHS-SE与乳糖醇酶促合成CHS-SE-LA.产物采用硅胶色谱柱分离纯化；纯化产物经MS、NMR进行结构鉴定,证明产物为目标产物,而且反应位点专一发生在乳糖醇C-6位上；建立了反应体系中产物含量HPLC测定方法,经线性、精密度、适用性和专属性考察,证明此方法稳定、可靠、专属性好；通过对反应溶剂和酶的种类的筛选,得出最值反应溶剂和酶为：吡啶与丙酮混合溶剂(3：1)和Novozyme435酶；通过对反应时间、反应温度、底物摩尔比、加酶量单因素考察,得出反应时间,加酶量、底物摩尔比对酶促反应有显著影响；在此基础上,我们利用效应法优法反应条件,得出最佳工艺为：t,11.47h；Sr,8.94；En,7.7mg/mL；在给定的最优条件下,我们重复三次实验,结果产率大于92%。4以多烯紫杉醇(DOC)为模型药物,制备DOC普通脂质体、DOC半乳糖配体脂质体。首先建立脂质体中DOC含量的HPLC测定方法,通过线性、精密度、适用性和专属性考察,证明此法稳定可靠；考察了脂质体包封率测定方法,通过比较凝胶柱色谱法与薄膜透析法,确定采用凝胶色谱法测定包封率；考察了两种脂质体制备方法：注入法和薄膜法,通过比较两种制法得到的脂质体在外观,包封率和粒径的基础上,确立采用薄膜法；选取药脂比、磷脂与胆固醇比和DSPE.PEG2000用量为考察因素,采用正交设计优化脂质体制备工艺,得出最佳制备工艺参数为：药物与类脂的质量比为1:15.EPC-CH质量比为4：1.DSPE-PEG2000的加入量为6%；通过最优工艺制备三批样品,得包封率93%以上,粒径150nm左右。5以SD大鼠为动物模型,以静脉给药的方式考察了普通脂质体与半乳糖配体脂质体在大鼠体内的药代动力学特征。首先建立了血浆中DOC浓度的测定方法,通过方法学考察,证明此法可行；考察了血浆中DOC萃取方法,确立甲基叔丁基醚三次萃取法可行,回收率达77%以上,满足生物样品的提取要求；通过DAS2.0软件分析载药脂质体在体内的药代动力学参数,发现脂质体经半乳糖配体分子修饰后,半衰期明显减小,清除率有所增加。6制备了荧光标记的普通脂质体与配体脂质体,脂质体粒径70nm以下,荧光标记率99%以上。通过对比普通脂质体、半乳糖配体脂质体与HepG2细胞的接合率,发现半乳糖配体脂质体与HepG2细胞的接合率明显高于普通脂质体；半乳糖靶头与脂质体表面的距离对ASGPR受体的识别能力有显著影响；预先加入的乳糖可以抑制ASGPR对半乳糖配体分予的识别能力。结论：综上所述,我们研发出一种安全、稳定和高效的利用半乳糖化脂质体转运DOC药物至HepG2靶点细胞的方法。首行,我们利用酶催化法合成一种新型的两亲性糖酯分子CHS-SE-LA。然后利用蛋黄磷脂、胆固醇和CHS-SE-LA等制备半乳糖化脂质体。通过细胞结合和吞噬实验,确认半乳糖化脂质体可被ASGPR高效地识别。这些结果在帮助设计半乳糖化载体系统提供了非常有价值的信息。
【作者】聂华；
【导师】程怡；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】酶促合成；半乳糖配体；肝靶向脂质体；多烯紫杉醇；

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