17-β雌二醇调控绵羊输卵管上皮细胞β-防御素1基因表达过程中NF-κB信号通路的研究

【摘要】动物在自然界生存中会受到各种病菌侵染的威胁,因此动物在长期进化的过程中形成的先天性免疫系统可有效的对抗病原菌的侵染。防御素是一类富含半胱氨酸并广泛分布于各种动物组织和细胞的内源性阳离子抗菌肽(AMPs),是先天性免疫系统的重要组成部分。由于防御素具有广谱的细菌和病毒抗性,可有效对抗病原菌的侵染,但其所具有的细胞毒性会对细胞生长不利,因此对防御素表达调控的研究有着重要的意义。之前的研究表明在绵羊发情期间,其血液雌激素变化同绵羊生殖器官内SBD1表达呈正相关,说明雌激素可能参与绵羊生殖器官内SBD1的表达调控。进一步研究表明SBD1mRNA在绵羊输卵管黏膜层上皮细胞游离面的胞质内表达,而固有层、肌层、结缔组织中无表达,因此可进行体外雌激素对绵羊输卵管上皮细胞内SBD1表达调控机制的研究,以阐明雌激素对绵羊输卵管上皮细胞中SBD1表达的调控机制。通过RT-qPCR方法检测不同剂量17-β雌二醇在不同时间段对SBD1表达的影响,证实了SBD1表达量在细胞添加10-8ME2后6h左右达到最高。通过RT-qPCR方法检测细胞添加10-8ME2后0至10.5h后细胞内SBD1表达量变化,结果发现添加E2后SBD1表达量在1.5至10.5h呈现显著性升高(P<0.05),在3.5h为其最高表达量时间点。通过RT-qPCR方法检测了预孵育GPR30激动剂、ERs抑制剂或PKA、PKC和NF-κB信号通路关键蛋白抑制剂后再添加E2的细胞内SBD1在不同时间段的表达量变化,进一步证明了17-β雌二醇诱导SBD1的表达在前期需要通过GPR30所介导非基因组途径,且需要PKA、PKC和NF-κB三条信号通路的共同参与,而在后期需要雌激素受体所介导的基因组途径。实验通过蛋白质印迹方法、RT-qPCR方法检测了细胞添加E2后NF-κB信号通路关键蛋白和NF-κB基因在不同时间段表达量变化,并通过ChIP方法检测NF-κB蛋白结合SBD1启动子比率的变化,阐明了NF-κB信号通路在17-β雌二醇诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD1基因表达中的作用机制：静息状态下的NF-κB同抑制蛋白家族的IκB相结合形成无活性复合体游存于细胞胞浆内,加入的E2作为外界刺激因子同GPR30结合并产生一系列的级联反应；0.5h后IκB蛋自发生磷酸化生成p-IκB蛋白,随后p-IκB蛋白通过泛素化被降解,游离的NF-κB蛋白被转运至细胞核内,1h后转运入核的NF-κB蛋白同SBD1启动子结合并激活SBD1的转录；随着细胞质内I-κB蛋白的降低,细胞不断新生成I-κB并在外源17-β雌二醇继续刺激下发生磷酸化,但由于高表达SBD1的细胞毒性,细胞通过负反馈调节终止NF-κB信号通路,进而通过细胞内部磷酸化、脱磷酸化和泛素化使细胞内蛋白回归稳态。以上实验结果表明,17-β雌二醇诱导输卵管上皮细胞中SBD1的表达在前期需要通过GPR30所介导非基因组途径,且需要PKA、PKC和NF-κB信号通路三条信号通路的共同参与,而在后期需要雌激素受体所介导的基因组途径。细胞通过蛋白磷酸化、泛素化、p65蛋白核转运和负反馈调节共同维持17-β雌二醇对SBD1表达的调控。
【作者】温世勇；
【导师】曹贵方；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】17β-雌二醇；绵羊；输卵管上皮细胞；绵羊防御素1；NF-κB信号通路；

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