草鱼蛋白激酶Z(CiPKZ)的表达与亚细胞定位及2种鱼类组织学形态研究

【摘要】PKZ(proteinkinasecontainingZ-DNAbindingdomain)是新近在鱼类中发现的一种非常独特的蛋白激酶,其既是eIF2a激酶家族的新成员,又属于Z-DNA结合蛋白家族。其N-端为调控区,由Z-DNA结合域(Zα1和Zα2)组成,C-端则为eIF2a激酶催化亚域。之前的研究表明PKZ能被PolyI:C、干扰素、病毒、热休克等诱导上调,这意味着与PKR相似,其除了具有潜在的抗病毒功能外,PKZ可能还是一个胞内调节者能对许多应激反应产生应答。将斑马鱼PKZ与荧光素酶报道基因共转染至哺乳动物HEK293T和CHO细胞,研究表明DrPKZ能够强烈下调荧光素的活性。大西洋鲑PKZ则能够强烈抑制β-gal的表达。我们前期的研究也表明鱼类PKZ具有非常典型的eIF2a激酶激酶特征。虽然如此,我们对PKZ在“应急反应→Z-DNA或Z-RNA的产生→细胞凋亡”信号通路中的地位还不清楚,对PKZ在细胞内的精确定位研究或许将有助于揭示PKZ在抗病毒机制中是如何发挥其作用的。草鱼全长cDNA(GU299765)近期已成功克隆和鉴定,在草鱼CiPKZ的N-端由Z-DNA结合域Zα1(1-67aa)和Zα2(81-152aa)组成。Zα是PKZ区别于其他eIF2a激酶的一个显著结构。为获得抗C/PKZzα基因的多克隆抗体,在实验室前期研究基础上设计C/PKZzα的PCR引物,采用PCR扩增CiPKZzα基因,经序列测定正确后,连接到pET-32a质粒上,将获得的重组质粒pET-32a-PKZzα转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE检测发现C/PKZzα融合蛋白以可溶形式存在于37℃诱导表达的上清中,大小约为32kDa。采用Ni-NTA亲和层析柱对C/PKZzα融合蛋白进行纯化。对纯化得到的CiPKZzα蛋白进行SDS-PAGE及Westernblot免疫印记杂交检测,得到了单一条带。用获得的高纯度融合蛋白免疫新西兰兔,得到兔来源的抗C/PKZzα血清。对抗血清进行蛋白免疫印记杂交反应和酶联免疫吸附反应检测,结果显示成功制备了高滴度和特异性的兔抗C/PKZzα多克隆抗体。采用免疫组织化学对草鱼肝、脾、肾等组织中PKZ进行检测,发现PKZ在组织中具有广谱表达,且经PolyI:C诱导7天后,在肝、脾、肾组织中均检测到PKZ的高表达,表明PolyI:C能诱导PKZ表达上调。研究发现在肝细胞核及细胞质中均有PKZ存在。而在脾,肾组织中只在细胞质中发现有PKZ存在。在本研究中同时亦采用RT-PCR对草鱼的肝、脾、肾、肠、鳃、心等六种组织中CiPKZ基因的组织表达特性进行检测时发现,在草鱼肝、脾、肾、肠、鳃、心等组织中均有CiPKZ的表达,表明PKZ在草鱼组织中具有广谱表达性。且经PolyI:C诱导后,以上组织中PKZ表达均有上调。草鱼的肝、脾、肾、肠、鳃、心在PolyI:C分别诱导0h,6h,12h,18h,24h,48h及在GCHV分别诱导0h,6h,12h,18h,24h,48h,72h后,PKZ表达量较诱导前均有不同程度上调,但在不同诱导时间后,各组织中PKZ的表达量出现峰值时间上具有差异性。采用光镜技术对草食性草鱼及肉食性乌鱼肠道进行组织学比较研究。结果表明,草鱼肠壁由内向外分为粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层四层。粘膜层由上皮、固有膜、粘膜肌层等组成。肉食性的乌鱼肠组织学结构特征与草鱼的基本相同。不同之处在于：乌鱼肠腔直径小,肠褶形状为纵褶,呈线状,排列较密。乌鱼的粘膜皱褶一般较高,杯状细胞相对较少而大,中央乳糜管明显。草鱼肠腔直径大,肠褶形状为横褶,排列较疏。草鱼的粘膜皱褶一般较低,杯状细胞相对乌鱼较多而小,中央乳糜管不如乌鱼明显。
【作者】范丽华；
【导师】胡成钰；
【作者基本信息】南昌大学，动物学，2012，博士
【关键词】PKZ；Za；免疫组织化学；Westernblot；RT-PCR；草鱼；肠道；组织学；

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