古菌质粒pRN2的遗传分析与转化操作系统的构建

【摘要】冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)REN1H1分离出了两个隐蔽性质粒pRN1和pRN2,两个质粒可能来源于共同的祖先,但复制各自独立。这两个质粒构成有很多的相似之处,都有三个保守的基因：repA,copG和plrA。在质粒pRN1中,repA是一个大的复制蛋白,904个氨基酸,N端编码Primase/Pol活性,C端推测有Helicase活性。Lipps等将RepA克隆到大肠杆菌中表达,纯化蛋白测定Primase的活性,发现其能够合成dNTP和NTP掺杂的引物。对copG的分析研究表明,该基因的表达产物能够与自身启动子区段结合。由于pRNl中copG和repA基因重叠,Lipps等推测copG是一个调控质粒拷贝数的蛋白。P1rA在pRN质粒中高度保守,异源表达实验发现蛋白可形成二聚体与自身启动子结合。鉴于以上研究结果,Lipps实验室尝试以pRN1质粒为蓝本构建了表达载体,但因为质粒不稳定,转化困难,该载体系统并未被领域内相关研究者广泛采用。pRN2质粒比pRNl质粒拷贝数高,在古菌中更容易操作。因此,通过研究pRN2质粒可以开发出具有前景的古菌遗传操作系统。本研究以尿嘧啶利用缺陷型的冰岛硫化叶菌E233为受体菌,运用完整的pyrEF基因作为筛选标记构建pGEF载体,然后将质粒pRN2上的不同片段克隆到载体pGEF上构建重组pRN2衍生质粒,电转化E233受体菌,根据重组质粒能否在受体宿主中复制得到pRN2的最小稳定复制单位为重组质粒pZC1包含的序列,即完整的orf89、copG和repA以及ori序列。测试重组衍生质粒的稳定性发现,连续传代200代后,pZC1的质粒丢失率为6%。缺失copG的重组质粒pSD丢失率为1.9%,然而缺失orf89的重组质粒pSX丢失率大幅上升为47%。qPCR的结果表明pSD质粒的稳定性最高,大约在13～15拷贝之间。pSX稳定性不佳,在细胞对数生长期开始时拷贝数高,对数中期有所降低,后期又有增加的趋势,这部分结果预示着copG可能并不是控制质粒pRN2稳定性和拷贝数的一个关键基因,似乎orf89才是真正其作用的基因。通过测试重组质粒pZC1的转录情况,发现orf89和copG存在共转录,orf89存在一个反向转录的ct89,确证了orf980的转录终止子。分析orf89蛋白的结构和功能,我们将orf89的基因克隆到表达质粒pET32a上,在大肠杆菌rosetta中成功表达了orf89融合蛋白,以融合的orf89蛋白做EMSA分析,表明orf89蛋白对自身的orf89基因上游序列,或者说对ct89的转录起到调控作用。由于orf89和copG的共转录,而ct89的转录势必影响到两种蛋白的表达,ct89和orf89分别从转录水平和蛋白质水平实现对基因开关的双重控制。通过对比SulfolobusislandicusREY15A菌株的CRISPR93序列发现,pRN1和pRN2的repA基因保守helicase区域位于CRISPR93的spacer56中。对该序列进行突变构建的重组质粒转化宿主菌,结果表明序列相似度和质粒的转化效率呈负相关。
【作者】林金钟；
【导师】佘群新；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】冰岛硫化叶菌；pRN2；最小复制单位；基因转录；copG；orf89；CRISPR；

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