MicroRNA-1通过抑制HDAC4调控软骨细胞表型研究

【摘要】研究背景：生长板决定肢体的长度，然而生长板中肥大的软骨细胞控制了肢体长度增加的速率。最近研究发现，在骨骼的发育过程中，HDAC4可调控软骨细胞肥大。近年来，miRNAs在关节软骨发育过程中的作用逐渐引起了人们的广泛关注。miRNAs与转录因子、信号分子等形成的调节网参与了软骨形成过程。有研究发现，在体外培养下，miR-1对骨骼肌增生和分化有直接的调节作用，且miR-1通过靶作用于HDAC4促进肌细胞生成。我们前期的大量研究表明，miR-1在关节软骨中特异性表达，且在肥大区软骨组织中的表达明显高于增生区；通过对miR-1过表达的软骨细胞增殖、分化及代谢特点的系统分析，以及其通过HDAC4参与关节软骨增殖分化的分析，对了解miR-1在关节软骨表型调控中的作用机制及其作为重要的调控因子参与软骨组织的发育过程具有积极的作用。研究目的：（1）分析不同组织及软骨组织不同分区miR-1表达情况，建立和完善miR-1分布的时相性；（2）在软骨细胞体外培养过程中，分析miR-1过表达对软骨细胞增殖、分化及代谢特点的影响，探讨其在关节软骨生长发育机制中的作用；（3）分析软骨细胞体外培养过程中，miR-1过表达HDAC4蛋白水平和基因水平的变化特点，以及miR-1、HDAC4与Runx2三者之间的通路分析，探讨其在调控关节软骨表型中的作用。研究内容：本课题进行了以下三项相关研究：（1）不同组织中miR-1表达情况分析：①分别取大鼠心、肺、脑、小肠、肝脏组织，人的软骨组织，鸡的生长板组织，应用NorthernBlot方法检测不同组织中miR-1表达情况。②16日龄的鸡胚，取其胸骨并分离增生区和肥大区软骨组织，应用RT-PCR、Northernblot及Real-timePCR方法，分析miR-1在胸骨增生区和肥大区软骨组织中的表达。（2）miR-1对软骨细胞增殖和分化影响分析：①取16日龄的鸡胚，取其胸骨并分离软骨细胞进行原代培养，并按120nM进行miR-1/Anti-miR-1及其对照的细胞转染。利用激光共聚焦显微镜观察软骨细胞中miR-1的转染效率，应用Real-timePCR分析转染后miR-1的表达。②miR-1对软骨细胞增殖影响分析：利用EDU方法检测细胞转染后，miR-1对软骨细胞增殖能力的影响；进一步通过CCK-8法分析细胞转染后，不同时间点miR-1对软骨细胞增殖能力的影响；收集培养上清液通过阿尔新兰沉淀法、ELISA分析糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、MMP-13及TIMP-1的分泌含量；通过Realtime-PCR技术分析Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox9、Ihh、MMP-13及Runx2等指标mRNA的表达。（3）miR-1通过HDAC4调控软骨细胞表型机制研究：①以120nMmiR-1/Anti-miR-1及其对照转染软骨细胞，培养48h后，Westernblot检测HDAC4蛋白表达；进一步用不同浓度miR-1转染软骨细胞，Westernblot检测HDAC4蛋白表达。②软骨细胞分别转染HDAC43’UTRwildtype及其敲除部分与miR-1互补基因片断的质粒，同时转染miR-1，化学发光仪分析Relativeluciferaseactivity；软骨细胞转染pGL3-HDAC4质粒，同时转染miR-1或mut-miR-1或miR-133，化学发光仪分析Relativeluciferaseactivity。③软骨细胞同时转染Runx2promoter及其不同浓度的HDAC4promoter；另一组软骨细胞转染Runx2promoter、HDAC4promoter及其miR-1；两组分别检测Relativeluciferaseactivity。研究结果与结论：（1）miR-1在小鼠心脏、人的关节软骨、鸡的生长板中有表达，但在小鼠脑、肺脏、小肠及肝脏组织中不表达。在鸡胚胸骨肥大区miR-1含量明显高于增生区；肥大的MCT细胞中miR-1表达较增生的明显增高（p<0.05）。（2）分离培养鸡胚胸骨软骨细胞，待细胞达70%的融合后进行miR-1/Anti-miR-1及其对照剂的转染。软骨细胞增殖：EDU、CCK-8分析显示：miR-1过表达能促进软骨细胞的增殖（p<0.05），而抑制miR-1软骨细胞的增殖能力下降（p<0.05）。在体外培养过程中，miR-1过表达Ⅱ型胶原、Sox9及MMP-13等指标在基因水平上表达量增加；而抑制miR-1，Ⅱ型胶原和Sox9等指标在基因水平上表达量下降。同时，培养上清液miR-1过表达Ⅱ型胶原、TIMP-1含量增高，Ⅹ型胶原、MMP-13含量下降；而抑制miR-1，Ⅱ型胶原、TIMP-1含量降低，Ⅹ型胶原、MMP-13含量升高。软骨细胞肥大：在体外培养过程中，miR-1过表达IHH、ColⅩ在基因水平上表达量增加；而抑制miR-1，IHH、ColⅩ指标在基因水平上表达量下降。（3）在体外培养条件下，miR-1过表达抑制HDAC4蛋白及HDAC43’UTR报告基因活性表达；相反，抑制miR-1减弱了对HDAC4的抑制作用。敲除HDAC43’-UTR的miR-1结合位点，或miR-1基因突变，减轻了miR-1对报告基因活性的抑制；过表达HDAC4抑制miR-1对软骨细胞肥大的促进作用。HDAC4对Runx2报告基因的抑制作用呈现剂量依赖性；miR-1促进Runx2报告基因活性；相反，HDAC4抑制miR-1对Runx2报告基因活性促进作用。提示，miR-1通过与HDAC43’-UTR互补序列结合抑制降解靶mRNA、阻遏靶HDAC4mRNA的翻译。
【作者】李鹏翠；
【导师】卫小春；
【作者基本信息】山西医科大学，骨外学，2014，博士
【关键词】微小RNA；软骨细胞；分化；HDAC4；

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