Hepcidin在非小细胞肺癌中的表达及其促进肺癌细胞增殖生长的研究

【摘要】目的：肺癌是世界上最常见的癌症,每年新发病例接近120万,同时也是男性癌症死亡的主要原因。而在女性中,肺癌是第四常见的癌症,也是癌症死亡中排名第二的主要原因.根据组织学形态分类,肺癌可以被分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两种类型,而非小细胞肺癌在原发肺癌中所占比例超过85%。铁是所有生命细胞基本活动所必需的。很多动物模型和流行病学调查表明,过量的铁是促进恶性肿瘤产生的重要原因之一。研究发现,机体内铁代谢的调控跟Hepcidin关系十分密切。Hepcidin是一种主要由肝脏合成分泌的小分子多肽,在心脏、脑、肺、胰腺等其他组织器官中也有一定的表达。人类Hepcidin由HAMP基因转录并翻译。Hepcidin主要是通过与细胞表面控制铁释放的膜铁转运蛋白Ferroportin的结合,使其被内陷入细胞质中被溶酶体吞噬降解,从而抑制细胞内铁的输出。近来对于Hepcidin在肿瘤中的关系和作用越来越受重视,研究显示Hepcidin在肝细胞癌和肾细胞癌中的表达是下调的,但在结肠癌和乳腺癌中表达却升高。目前尚无相关研究报道Hepcidin与肺癌的关系,因此本课题着重于研究Hepcidin-25在NSCLC患者血液循环中的表达情况,分析Hepcidin和其相关信号通路因子IL-6及BMP在NSCLC患者中的关系；检测Hepcidin在肺癌组织标本中的表达水平,分析其与病理学特征的关系；进一步通过细胞生物学实验分析Hepcidin与肺癌细胞生长情况的关系,并且研究并初步阐明Hepcidin在肺癌细胞增殖生长过程中的作用机制。方法：采用酶联免疫法(ELISA)分别检测53例NSCLC患者和16例健康志愿者的血清Hepcidin-25、IL-6和BMP2的含量水平,分析与肺癌病理学特征之间的关系以及相互之间的关系。通过实时荧光定量PCR检测65例NSCLC患者的肺癌组织样本和正常肺组织样本中的HepcidinmRNA表达水平；同时用免疫组织化学法检测65例NSCLC组织标本和57例正常肺组织标本中Hepcidin的定位及表达情况。进一步测定了6种NSCLC细胞株和支气管上皮细胞株HBE中HepcidinmRNA的表达水平,选择表达合适的H520细胞株通过细胞免疫荧光观察Hepcidin在细胞内的表达情况；构建Hepcidin真核表达载体使Hepcidin在HBE细胞内过表达,运用WST-8试验和细胞平板克隆形成试验研究Hepcidin表达水平升高对细胞增殖生长的影响；同时用RNA干扰技术降低H520细胞内Hepcidin的表达,运用WST-8试验和细胞平板克隆形成试验研究Hepcidin表达水平下降对细胞增殖生长的影响；通过WST-8试验检测人工合成Hepcidin结合域(HBD)对H520细胞的影响,分析HBD在肺癌细胞生长过程中的作用。此外还应用荧光测量法检测Hepcidin过表达的HBE细胞和Hepcidin表达下降的H520细胞内的可变铁池(LIP)的变化,进一步阐明Hepcidin促进肺癌细胞增殖生长的机制。结果：NSCLC患者的血清Hepcidin-25显著高于健康志愿者(P=0.004)。NSCLC患者血清Hepcidin-25水平随NSCLC的淋巴结转移的发生而升高(P=0.044)；同时,血清Hepcidin-25水平还跟TNM临床分期呈正相关,随临床分期的提高而升高(P=0.017)。通过进一步检测发现IL-6在NSCLC患者和健康志愿者之间没有明显差别(P=0.917),但是发现IL-6水平在NSCLC患者中随着肺癌淋巴结转移的发生(P=0.018)和TNM临床分期的提高(P=0.041)而下降。血清BMP-2在NSCLC患者中的含量水平要显著高于健康志愿者(P<0.01)；而BMP-2水平跟淋巴结转移的发生(P=0.011)和TNM临床分期(P=0.001)呈正相关。通过spearman.s相关系数分析发现,在NSCLC患者中,Hepcidin-25和IL-6含量成负相关(r=-0.242,P=0.049),而与BMP-2呈正相关(r=0.737,P<0.001)实时荧光定量PCR检测发现65例NSCLC患者的肺癌组织标本中有67.7%的HepcidinmRNA表达高于正常肺组织,只有30.8%低于正常肺组织,仅有1.5%与正常肺组织无差异,说明NSCLC组织标本的HepcidinmRNA表达升高(P<0.01)；通过HepcidinmRNA相对于beta-actin的比值(即2-△CT值)进行log10换算标准化进行统计比较也得出肺癌组织标本的HepcidinmRNA表达升高(P=0.001)；此外,分析发现肺癌组织标本中HepcidinmRNA与肺癌淋巴结转移的发生呈正相关(P=0.041),并且与血清Hepcidin-25水平呈正相关(r=0.280,P=0.042)。免疫组织化学显示非小细胞肺癌中的Hepcidin阳性表达较正常肺组织明显提高(P<0.05)通过实时荧光定量PCR检测发现6种非小细胞肺癌细胞株有4种HepcidinmRNA较HBE表达升高,仅有2种表达降低。我们选择HepcidinmRNA表达最高的H520细胞株进行细胞免疫荧光实验,观察发现Hepcidin在H520细胞中显著表达,且主要集中于细胞质及近细胞膜部分。成功构建Hepcidin真核表达载体,并成功将其转入HBE细胞使其稳定高表达Hepcidin;WST-8试验和平板克隆形成试验表明,Hepcidin表达水平提高对HBE细胞的增殖生长有明显的促进作用。使用RNA干扰技术对H520细胞进行Hepcidin基因沉默；WST-8试验和平板克隆形成试验表明,Hepcidin表达水平下降对H520细胞的增殖生长有着明显的抑制作用。用人工合成的HBD对H520细胞增殖生长进行干预后发现,被HBD干预后的H520细胞其增殖生长受到了一定的抑制。荧光测量法检测细胞内的可变铁池(LIP)的结果表明,提高HBE细胞内Hepcidin的表达可以使细胞内铁浓度升高,而降低H520细胞内Hepcidin的表达却使其细胞内铁浓度下降。结论：Hepcidin在非小细胞肺癌患者血清及肺癌组织中表达明显升高,并且与肺癌淋巴结的转移以及临床分期呈正相关。同时,NSCLC患者的血清BMP-2含量明显增加,与肺癌淋巴结转移以及临床分期呈正相关,并与血清Hepcidin-25水平呈正相关,证实了BMP-2可能是调节Hepcidin的关键因素。通过体外细胞实验证实了Hepcidin能够促进肺癌细胞的增殖生长,其与细胞内铁浓度的改变相关,阐述了Hepcidin-Ferroportin-铁这个调控轴对肺癌细胞增殖生长的作用机制。本实验研究认为Hepcidin可以作为肿瘤治疗的一个新的靶点,为肿瘤治疗方法提供新的研究基础和研究思路,此外HBD可能作为一种新的分子药物为肿瘤治疗带来新途径。
【作者】陈倩；
【导师】喻风雷；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】Hepcidin；非小细胞肺癌；Ferroportin；白介素-6；骨形态发生蛋白-2；Hepcidin结合域；铁；

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