玉兰花粉超低温保存机制研究

【摘要】超低温保存是一项广泛应用于水产养殖、资源保护和医药等领域的生物技术,在理论上具有“永久性”保存生物材料的特点。尽管技术研究的发展大大提高了保存后生物材料的生活力,但冷冻和解冻仍然会对许多材料的原始功能产生负面影响,甚至会引起细胞广泛的致死或亚致死。技术的突破依赖于机制理论研究的成果,超低温保存的机制不清已成为其技术发展的主要瓶颈。超低温保存是花粉长期保存的适宜方式,并且已经成功地应用于多种物种的花粉保存。作为少数几种可以无需经过复杂的脱水和冷冻保护剂的参与即可直接投入液氮成功实现超低温保存的单细胞材料,花粉无疑是超低温保存机制研究的理想模板。本文以玉兰花粉为主要的试验材料,研究了超低温保存对其生理和分子层面所造成的影响,在此基础上,探讨花粉超低温保存的相关机制。其主要研究结果如下：1)扩建了课题组前期建立的园林植物超低温保存花粉库,成功实现了59种／品种植物花粉长达1年的液氮超低温保存,共涉及了17个科44个属的木本和草本的园林植物。2)选择超低温保存前后生活力没有显著变化的玉兰花粉作为试验材料,对超低温保存前后与氧化应激和细胞凋亡相关的指标进行测定,其中活性氧水平和丙二醛含量在花粉超低温保存前后没有显著变化,而质膜相对透性在超低温保存后显著提高,说明脂质过氧化不是造成细胞膜通透性增强的直接原因；超低温保存后过氧化氢酶活性显著升高,而抗坏血酸含量显著下降,说明超低温保存引起了玉兰花粉细胞内抗氧化防御系统的显著变化,细胞通过氧化／抗氧化系统的自我调节取得了新的平衡,因而使活性氧的水平在保存前后维持了稳定,并未诱导氧化应激的发生；对磷脂酰丝氨酸的外化水平和DNA片段化程度的测定表明,超低温保存并未引起细胞凋亡现象的发生。3)采用蛋白质组学技术研究玉兰花粉超低温保存前、中、后可溶性蛋白质的变化,共获得丰度变化在1.5倍以上的差异表达蛋白质点88个；选择三组比较中两组差异均显著的蛋白质点11个和表达量变化大于5倍的点6个进行质谱检测,获得有效鉴定8个,分别是：内质网网眼结合蛋白5、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢酶同工酶3、假定脱氢酶、烯酰(基)ACP还原酶、天门冬氨酸氨基转移酶、无机焦磷酸酶和线粒体苹果酸脱氢酶,功能涉及了蛋白质折叠、抗氧化作用、三羧酸循环、嘧啶降解、脂肪酸合成、苹果酸-天冬氨酸转运、无机焦磷酸的利用等多个细胞生命过程。4)对8个差异蛋白的转录水平变化进行研究,获得其中2个——假定脱氢酶和烯酰(基)ACP还原酶——在超低温保存前、中、后的基因转录水平变化,对比其蛋白质水平的变化表明,两者之间存在不一致性,认为蛋白质的表达变化可能更多地来自于基因的翻译水平和翻译后水平调控,而不是基因的转录水平调控。5)为了验证差异蛋白质在超低温保存中的功能,选择其中的过氧化氢酶和苹果酸脱氢酶,将其同源替代物应用于扶芳藤和卷丹茎尖的玻璃化超低温保存,其结果表明：在适宜的阶段,将适宜浓度的过氧化氢酶或苹果酸脱氢酶添加于玻璃化超低温保存使用的溶液中能提高保存后茎尖的存活率和再生率。这在一定程度上证明了玉兰花粉超低温保存所鉴定的差异蛋白质在超低温保存进程中发挥着积极的保护作用。本研究的主要贡献在于扩建了课题组前期建立的园林植物超低温保存花粉库；证实了保存前后生活力没有显著变化的玉兰花粉在超低温保存过程中不存在氧化应激和细胞凋亡；获得玉兰花粉超低温保存前、中、后8个差异表达的蛋白质,并验证了其中2个蛋白质与超低温保存相关。
【作者】徐瑾；
【导师】刘燕；
【作者基本信息】北京林业大学，园林植物与观赏园艺，2014，博士
【关键词】玉兰花粉；超低温保存；差异蛋白；氧化应激和/或细胞凋亡；冷冻保护剂；

【参考文献】
[1]郑子恒.东方电气集团领导人员经济责任审计案例研究[D].湖南大学,MPAcc,2013,硕士.
[2]李恒胜.我国食品安全法律规制研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[3]石宏宾.话题为主的词汇学习策略对词汇记忆的影响[D].西北师范大学,教育,2003,硕士.
[4]喻志鸿.高校图书馆个性化服务系统设计及实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[5]牟尧.微生物转化井冈霉素制备假氨基糖类α-糖苷酶抑制剂的研究[D].上海师范大学,微生物学,2013,硕士.
[6]徐保林.具有带阻特性的小型化超宽带微带天线的设计及应用[D].成都理工大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[7]杨潇.王海鸰小说语言风格研究[D].西北师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[8]冯伟明.考虑冰灾的电网运行风险评估及网络化保护[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2014,硕士.
[9]张钟秀.基于PLIF/Mie煤油超雾化粒径二维分布测量研究[D].中国科学技术大学,机械电子工程,2014,硕士.
[10]郭雨春.2013全国第十八届自动化应用技术学术交流会召开[J].冶金自动化,2013,06:77-78.
[11]范小海.威密尔目的论视角下商务口译中的变译[D].内蒙古大学,翻译,2014,硕士.
[12]裘恩.个人承包经营者招用的劳动者的劳动关系判断[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[13]吴通华,蒋雷海,李友军,吴海,陈建玉,郑玉平.电力系统电气量异常采样值实时辨识方法[J].电力系统自动化,2011,23:95-98.
[14]郭学磊.我国土壤污染防治法律制度研究[D].石家庄经济学院,环境与资源保护法学,2012,硕士.
[15]张建兵.基于GIS的资源储量管理系统设计与实现[D].西安科技大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[16]李珂.火电企业技改项目投资效益后评价及应用[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[17]赵乐.戈尔巴乔夫时期苏联政治文化及其对苏联政治的影响[D].四川省社会科学院,中外政治制度,2014,硕士.
[18]吕琳君.智能优化算法在集成电路设计中的应用研究[D].南京邮电大学,电路与系统,2013,硕士.
[19]卢章疑.并行空间自适应多重网格集成电路热分析方法[D].复旦大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[20]徐勤.可溶性TGF-βⅡ型受体基因治疗大鼠放射性肺纤维化的实验研究[D].浙江大学,免疫学,2004,硕士.
[21]何维.低碳背景下沿海地区企业办公楼集约化设计研究[D].湖南大学,建筑学,2012,硕士.
[22]吴光伟.新公共管理视野下数字档案馆建构[D].浙江大学,2004.
[23]姬明丽.非小细胞肺癌药物敏感性试验及耐药机制探讨[D].山西医科大学,病理学,2003,硕士.
[24]高筠钧.基于城市形态学理论的青岛信号山历史街区保护与更新研究[D].青岛理工大学,建筑历史与理论,2012,硕士.
[25]宁贞.第三国倾销的法律问题研究[D].苏州大学,国际法,2014,硕士.
[26]XieFei.从目的论角度看化妆品说明书的汉译[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[27]秦健.基于信息可视化与数据挖掘的高校图书馆推荐系统的设计与实现[D].北京交通大学,2014.
[28]许筠芸.移动微博客户端用户发布行为意愿影响因素研究[D].浙江大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[29]刘欣,梁雷,赵丽芬,何海峰,靳涛.改性石墨烯/溴化丁基橡胶纳米复合材料的制备、表征及性能（英文）[J].合成橡胶工业,2014,01:73.
[30]刘德志.城市火灾报警智能监控终端的研究与应用[D].广东工业大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[31]本报特约撰稿吴康迪.石墨烯何以结缘诺贝尔奖[N].计算机世界,2010-10-25037.
[32]夏燕飞.转折关系复句的偏误分析与教学对策[D].上海外国语大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[33]孟根.《黄金史》领属范畴研究[D].内蒙古师范大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[34]谢日恒.从一则外资股权转让纠纷案看合同效力[D].沈阳师范大学,法律,2014,硕士.
[35]宋金霞.关于建立中国西部中小企业融资体系的构想[D].中央民族大学,中国少数民族经济,2004,硕士.
[36]彭星烁.去甲肾上腺素诱导HSP70的表达对隐睾生殖细胞凋亡的影响[D].遵义医学院,卫生毒理学,2013,硕士.
[37]李辉.翻译硕士专业学生口译笔记训练情况调研报告[D].河北师范大学,翻译,2013,硕士.
[38]王航.软件脆弱性测试技术[D].中国科学院研究生院（软件研究所）,2003.
[39]贾胜男.反思文学中的忏悔意识[D].河北师范大学,文艺学,2013,硕士.
[40]孙立立.试比较陶渊明和鸭长明的隐逸[D].吉林大学,日语语言文学,2014,硕士.
[41]刘明辉.1950-1965年：毛泽东著作学习运动研究[D].华中师范大学,中共党史,2013,硕士.
[42]朱汉卫.数字化设计院的IT规划[J].中国勘察设计,2005,09:49-51.
[43]梁春钰.论企业人力资本投资的效能[D].广东工业大学,企业管理,2004,硕士.
[44]程屾.内外表面熔焊管强化凝结传热实验研究与机制分析[D].山东大学,热能工程,2014,博士.
[45]刘成竹.PVP辅助下合成Ag/AgBr/TiO_2纳米材料及其可见光催化性质[D].东北师范大学,物理化学,2012,硕士.
[46]彭秀华.大坝运行对中华鲟自然繁殖影响及修复措施研究[D].三峡大学,水利水电工程,2013,硕士.
[47]黄项项.校园一卡通系统设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[48]李永胜.基于理性的诗和艺术及其超越[D].中国社会科学院研究生院,文艺学,2014,硕士.
[49]马永海.数模中如何考虑相对渗透率曲线的不稳定性[J].新疆石油地质.1993(04)
[50]杨青.外交关系对双边贸易的影响[D].外交学院,世界经济,2014,硕士.