异齿亚纲贝类DNA条形码与系统发生学研究

【摘要】异齿亚纲（Heterodonta）隶属于双壳纲软体动物门，种类繁多，现存约2600种，分布于帘蛤目（Veneroida）和海螂目（Myoida）两大目，是双壳贝类中种类最为丰富、分布最为广泛的一个亚纲。异齿亚纲贝类外部形变化大，贝壳形式多种多样，具有极其丰富的生物多样性。和其他软体动物门类一样，异齿亚纲贝类传统分类学建立的重要依据是贝壳的表观特征（大小、质地、壳型、铰合部、铰合齿、内外韧带、壳表二级结构等）、成体软体部的组织和器官的解剖结构（闭壳肌的数目和形状、鳃的结构、外套窦、外套线、接合线、水管触手的形态与分布等）以及生态学特征（食性、栖息环境等）。然而，这些分类特征不但多样性程度高而且可塑性极大，因为受到外部环境、种间平行进化与种内生态型繁杂等因素的影响，某些分类群种内差异性较大而种间差异性较小甚至存在相互重叠的现象，而有些物种的不同地理群体之间却因长期隔离具有较大的差异性。这都使得利用传统的形态学方法对异齿亚纲贝类进行物种鉴定和系统发育分析变得极其困难，从而导致异齿亚纲贝类的分类处于相对混乱状态，特别是种以上水平。因此，形态学方法亟需一种效率更高、通用性更强、更加经济便捷的方法来进行分类和系统发育学研究以辅助其发展。利用DNA序列进行物种多样性分析成为一种有效的研究途径。最新提出的DNA条形码（DNAbarcoding）技术，作为一种用于物种鉴定的新兴技术正引起广泛的关注。它利用一段短的线粒体DNA序列作为物种快速鉴定的标记，并希望以此建立DNA序列和生物物种之间一一对应的关系。DNA序列不仅能用来有效地鉴定物种，而且还能推断物种间的系统发生关系，这就是所谓的分子系统学。分子系统学的发展有助于我们更深刻地理解各物种间的演化关系。DNA条形码技术能弥补传统形态学鉴定的缺陷，已成功应用于动物、植物及微生物界，极大地推动了生物多样性研究的发展。但它的推行也引起了许多的争议。本研究我们首先验证了DNA条形码技术及其分析方法的可行性，然后利用DNA条形码技术和相关标记对异齿亚纲贝类进行了全面的物种鉴定和系统发育研究。具体研究结果如下：1．五种DNA条形码分析方法鉴定樱蛤总科贝类的比较研究对采自中国沿海的樱蛤总科16个种68个个体的线粒体COI和16SrRNA基因的部分序列进行了测序，其它10个物种的相应序列从GenBank中获得。以现行的形态学分类系统为基准，以鸟蛤总科4个物种为外类群，评估了五种DNA条形码方法（传统的距离法，ABGD法，单系法，GMYC法和CAOS法）在科、属、种不同分类水平上鉴定樱蛤总科26个形态学物种的有效性。研究结果显示：（1）对于COI和16SrDNA基因，特征分析法（CAOS）均可以正确鉴定所有研究的樱蛤总科的种类，并且可以有效区分一些属。所以CAOS特征法的适用性最高，特别是在较高的分类阶元。（2）对于距离法而言，它们能有效的区分大部分种类，新提出的ABGD法的鉴定效率等于或者略高于传统距离法，并没有显现出较大的优势。基于COI基因我们在种的水平上发现了宽度为1%的条形码间隙（barcodinggap），但是种以上分类阶元的遗传距离出现明显的重叠区，所以属及以上分类阶元的界限无法界定。（3）对于传统的聚类法（单系法）而言，基于COI和16S基因的贝叶斯树显示所有物种都以较高的支持度形成相互独立的单系群，但是仅有一个属显示为单系发生，也就是说单系法能够成功地鉴定出樱蛤总科所有的26个形态学物种，但是同样不适用于种上阶元的鉴定。而新提出的GMYC法鉴定效率十分不理想，基于COI基因，多增加了34.6%的物种；基于16SrRNA基因，多鉴定了约58.8%的物种。所以基于树形的DNA条形码方法仅适用于研究种及以下水平的亲缘关系。因此我们推断利用特征法DNA条形码技术鉴定物种的鉴定效率最好、适用性最广，但在初期鉴定物种阶段我们也推荐使用ABGD法和单系法。同时，本研究还发现COI比相对保守的16SrRNA基因更适合DNA条形码标记，特别是对于基于树形的条形码方法。2.基于距离法的异齿亚纲近缘种DNA条形码研究本节研究了异齿亚纲67个属263个近缘种共1042个个体的标准DNA条形码序列——COI基因序列。利用K2P遗传距离模型计算所得序列种内和属内种间两两间的遗传距离，并分析了其遗传距离相对分布频率。种内遗传距离和种间遗传距离存在着显著的重叠，条形码间隙（barcodinggap）在异齿亚纲近缘种间并不存在。我们分析了传统距离法，即10倍法则和3%阈值标准鉴定物种的效率。结果显示，10倍法则无法鉴定55.59%的物种，而3%阈值标准无法鉴定42.58%的物种。另外，我们检测了新提出的基于遗传距离的DNA条形码分析方法——条形码间隙自动检索法鉴定物种的效率。该方法较之于传统的遗传距离方法显现出较明显的优势。结果显示，它虽然能将这1042条序列划分为264个群组，在这264个群组的组成中有207个假定种的组成与NCBI分类系统相吻合。也就是说条形码间隙自动检索法能有效地区分78.70%的物种。与传统的距离DNA条形码方法相比，条形码间隙自动检索法有以下几个方面的优点：（1）不依赖于根据经验设定的单一的阈值标准，鉴定标准更加客观，而且针对于同一个数据集可以使用不同的鉴定标准；（2）适用条件更加宽泛，即使种内和种间遗传距离存在重叠也不影响它的有效性；（3）操作更加简便，省时、省力，更适用于大规模的物种初期鉴定工作。3.基于COI和16SrRNA基因的异齿亚纲系统发生学关系研究研究利用线粒体基因COI和16SrRNA进行贝叶斯和最大似然法分析呈现了异齿亚纲的系统发生关系。我们将获得的拓扑结构与传统划分的目、超科、科和属以及已发表过的分子学研究一起对比分析。结果显示在系统发生树上帘蛤目和海螂目并没有像期待的那样形成两个独立进化的分支。在总科的水平上，袖扣蛤总科、饰贝总科、同心蛤总科、鸟蛤总科、心蛤总科、竹蛏总科和厚壳蛤总科为单系；满月蛤总科、帘蛤总科、樱蛤总科、蛤蜊总科、蚬总科、海螂总科、海笋总科为并系或者复系。厚科蛤、星形蛤科和心蛤科显示了较近的亲缘关系，作为异齿亚纲内其它科的姐妹群形成了独立的分支。本研究中索足蛤科位于系统发育树的较基部的位置，远离了满月蛤总科。支持了Williamsetal.（2004）将无齿蛤科移除满月蛤总科的观点。鸟蛤总科和樱蛤总科、帘蛤总科和蛤蜊总科、竹蛏总科和袖扣蛤总科分别为姐妹群关系。樱蛤总科缢蛏属与竹蛏总科刀蛏属显示了较近的亲缘关系，具体分类地位需要进一步研究。帘蛤科与蛤蜊总科、北极蛤科、同心蛤总科和猿头蛤总科聚合成高支持度的分支。本研究有力说明了目前异齿亚纲的分类非常混乱，需要利用形态学、古生物学和分子数据进行校正。4.利用三种不同DNA条形码分析方法探究缢蛏属系统发生学关系本研究分析了采自中国沿海的樱蛤总科的16个物种以及竹蛏总科的4个物种的线粒体COI基因和16SrRNA基因序列，对缢蛏属系统发生关系和分类地位进行了研究。距离法、单系法和特征法条形码分析方法在本研究中得到成功的应用。研究结果表明，缢蛏属与樱蛤总科其他属的遗传距离远远大于其与竹蛏总科各属的遗传距离，与刀蛏属的遗传距离最小，序列的差异度最低、相似性最高。以鸟蛤总科为外群，利用COI和16SrRNA整合序列构建的贝叶斯系统发生树显示缢蛏属作为刀蛏属的姐妹群与荚蛏属紧紧地聚为一支，说明缢蛏属、刀蛏属和荚蛏属具有最近的共同祖先。特征法分析显示缢蛏属与参考系中刀蛏科特征碱基的匹配度最高，共同特征碱基数远远多于三个。综合形态学数据，本研究表明缢蛏属应划归竹蛏总科的刀蛏科。
【作者】于贞贞；
【导师】李琪；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】DNA条形码；系统发生；异齿亚纲；樱蛤总科；缢蛏属；COI；16SrDNA；

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