骨髓增生异常综合征的分层诊断及去甲基化分段治疗

【摘要】第一部分Th22细胞和Th17细胞在骨髓增生异常综合征中的差异化表达及其调控机制研究研究背景：骨髓增生异常综合征(MDS)是一组克隆性造血干/祖细胞疾病,主要表现为病态造血和高风险性向急性白血病进展。在MDS的发生、发展过程中,自身免疫介导的骨髓抑制及具有清除恶性克隆功能的免疫监视系统起重要作用。T淋巴细胞克隆性扩增,临床上免疫调节治疗效果可,均提示T辅助细胞和细胞毒性T细胞参与构成MDS的异常免疫系统。近来,一种新的能够产生IL-17并特异性表达转录因子RORC的T辅助细胞被人们发现,随即被命名为Th17细胞。Th17细胞在炎症免疫反应中的研究日益深入。IL-17A是Th17细胞的主要效应因子,被认为是多种免疫异常疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性骨髓瘤等的致病因素之一。有研究显示低危MDS患者外周血中Thl7细胞表达升高,但其异常细胞免疫的发生机制仍不明朗。Th22细胞是新近发现的一种新的CD4+T淋巴细胞亚群,其特点是分泌IL-22和TNF-α,而非IL-17或IFN-γ,亦不表达转录因子T-bet或RORC。在IL-6和TNF-α的促进作用下,芳香烃受体活化,初始性CD4+T细胞可以向Th22表型方向分化。有研究表明在炎症性皮肤异常病人中Th22细胞能够渗透进入表皮组织并参与调节表皮的炎症反应。Th22细胞表达水平亦被证实与胃癌疾病进展密切相关。综上所述,Th22细胞在炎症免疫和肿瘤免疫逃逸机制中均发挥重要作用。IL-22是一种IL-10家族细胞因子,可由活化的Th22和Th17细胞分泌。IL-22在炎症免疫反应和恶性肿瘤中的表达趋势不尽相同：它既可以与IL-17发挥协同作用,也可以独立发挥免疫调节作用。在炎症性皮肤病和间变性淋巴瘤激酶阳性的间变性大细胞淋巴瘤患者中IL-22表达上调,定向诱导免疫系统攻击自身的靶组织细胞。系统性红斑狼疮患者的IL-22表达下调。在炎症性肠病中,经由未致敏细胞或记忆-效应细胞的诱导,在不同微环境下IL-22既能够抑制炎症反应又可以促进炎症发生发展。迄今为止,尚未出现MDS中Th22细胞亚群相关的报道。为探究Th22细胞在MDS疾病发生发展中的致病机制,我们检测了早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th22、Th17及Thl细胞的表达情况；同时检测了外周血单个核细胞中转录因子RORC和调节因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的表达水平；并且检测了外周血血浆和骨髓上清中IL-22和IL-17的含量。此外,我们将不同的T细胞亚群进行了相关性分析,探讨Th细胞分化与MDS疾病预后分期的关系。研究目的：通过检测MDS患者外周血中Th22、Th17细胞所占的比例及转录因子RORC,调节因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的表达水平,研究调节性因子对早期MDS、晚期MDS患者外周血辅助性T细胞亚群Th22/Th17表达量的影响,探讨不同临床分期MDS患者的炎症免疫或免疫逃逸状态,从预后分期的角度寻找可以协助早期、晚期MDS临床诊断的免疫学指标。研究方法：1.收集17例早期MDS患者、20例晚期MDS患者及20例健康志愿者的外周血,同时采集25例MDS患者及10例肿瘤学炎症免疫学方面无异常的外科患者的骨髓。2.通过流式细胞术检测外周血Th22、Th17和Thl细胞在辅助性T细胞亚群中所占的比例。3.采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunoadsorbentassay,ELISA)检测外周血血浆和骨髓上清中细胞因子IL-22和IL-17的浓度。4.分离早期MDS、晚期MDS患者及健康志愿者的外周血单个核细胞,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术测定调节因子RORC.IL-6、TNF-α、IL-23mRNA的表达水平。5.统计分析：根据是否服从正态分布,结果数据以均数土标准差(mean土SD)或者中位数(数值区间)表示。比较两组数值变量之间的差异性时,根据数值变量是否服从正态分布,选择独立样本t检验或非参数检验进行分析。早期MDS、晚期MDS以及健康对照组三组之间比较差异性时,使用one-wayANOVA进行分析统计,其中任意两组之间比较差异性时用Newman-Keuls检验(q检验)两两比较法进行分析统计；当任何一组数值变量不符合正态分布时,应用Kruskal-Wallis检验(H检验)和Nemenyi检验进行分析统计。进行变量之间的相关性分析时,根据双变量是否均服从正态分布采用Pearson相关或Spearman等级相关方法进行分析统计。所有统计分析均使用SAS9.1软件进行。P<0.05定为具有统计学差异。研究结果：1.早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th22细胞的表达情况与正常对照组(0.71±0.17%)相比,Th22(CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+)细胞亚群在所有分期MDS患者外周血中所占比例显著增加(1.55±0.74%,P<0.0001)；Th22细胞在早期MDS患者外周血中所占的比例显著高于对照组(1.27±0.50%vs.0.71±0.17%,P=0.002)；与早期MDS患者相比,晚期MDS患者Th22细胞的表达量明显升高(1.77±0.84%vs.1.27±0.50%,P=0.03)。2.早期MDS患者、晚期MDS患者和健康志愿者外周Th17细胞的表达情况Th17(CD4+IL17+)细胞亚群在早期MDS患者外周血中所占的比例(1.90%；0.58-6.01%)显著高于晚期MDS组(1.16%；0.15-1.86%；P=0.002)以及对照组(0.97%；0.55-1.69%；P=0.002)。3.MDS患者和健康志愿者外周Thl细胞的表达情况外周血中Th1(CD4+IFN-γ+)细胞亚群在外周血中占辅助性T细胞的比例在MDS组以及对照组之间无明显差异。4.MDS组和对照组血浆和骨髓上清中IL-22和IL-17的水平血浆中IL-22的浓度在MDS组和健康对照组之间无显著性差异。骨髓上清中IL-22的浓度在两组之间亦无显著性差异。MDS组及健康对照组血浆中IL-17的浓度无统计学差异,骨髓上清中IL-17的浓度亦无统计学差异。5.早期MDS组、晚期MDS组和对照组外周血单个核细胞中转录因子RORC和调节因子IL-6、TNF-α及IL-23mRNA的相对定量表达在早期MDS组、晚期MDS组和健康对照组三组中,外周血单个核细胞转录因子RORC基因仅在早期MDS组表达明显升高(P=0.0007；P=0.002),外周血单个核细胞中调节性细胞因子IL-6及TNF-α基因仅在晚期MDS组表达显著增高(P<0.05；P<0.001)；外周血单个核细胞中IL-23基因表达水平在三组之间均无统计学差异。6.MDS患者外周T细胞亚群Th22、Th17及Thl细胞之间的关联性在早期MDS患者中,外周Th22与Th17细胞亚群的数目比例呈正相关(r=0.675,P=0.004)；然而,在晚期MDS患者中,外周Th22细胞与Th17细胞亚群的分化表达量无相关性(r=0.138,P=0.610)。在总体所有分期的MDS患者中,外周Th22亚群与Thl亚群的表达无相关性(P=0.053)。结论：早期MDS患者外周血中辅助性T细胞向Thl7亚群方向的分化量、转录因子RORCmRNA表达量显著增加；晚期MDS患者外周血中辅助性T细胞向Th22亚群方向的分化量、IL-6mRNA和]TNF-αmRNA表达量显著增加,提示Th22/Th17细胞参与调节早期MDS炎症免疫和晚期MDS免疫逃逸的异常免疫状态。就疾病分期而言,外周血中Th22/Th17比率对于早期、晚期MDS的分层诊断具有重要的免疫学指示意义。第二部分地西他滨分段治疗骨髓增生异常综合征及疗效评估体系研究背景：表观遗传学是指在不涉及核苷酸序列变化的情形下基因表达发生了改变,包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰等。细胞遗传学变化是MDS主要的发病机制,此外,单倍剂量不足、次级突变及表观遗传学改变等亦是MDS重要的致病机理。研究表明MDS表观遗传学改变主要表现为造血祖细胞内基因组水平上广泛的DNA甲基化和组蛋白乙酰化、甲基化,集中发生在抑癌基因及其他有丝分裂抑制因子的转录表达区域。高危型MDS异常甲基化位点的数目比低危型MDS异常甲基化位点多。转录启动子区DNA甲基转移酶DNMT3A和TET2异常甲基化比较普遍。DNMTs可以催化CpG岛中胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶,是MDS治疗的关键靶点。研究表明大剂量地西他滨具有细胞毒性,小剂量地西他滨则可以抑制DNMTs的活性,发挥去甲基化功能,使沉默的抑癌基因如E-cadherin,P16,hMLH1,VHL,P15,P21等恢复正常去甲基化状态而重新活化表达。美国食品药品监督管理局推荐DNMTs抑制剂地西他滨在临床上适用于治疗IPSS-R预后中危/高危/极高危MDS及其他治疗无效的较低危MDS。多项回顾性临床研究和前瞻性队列研究表明地西他滨可以使部分较高危MDS患者获得细胞遗传学改善,降低MDS向急性髓系白血病转化的风险,延长总生存期。但在地西他滨实际应用过程中,骨髓抑制发生率较高且多为III或IV级,主要表现为血小板减少、中性粒细胞减少和贫血。鉴于地西他滨传统治疗体系中常发生延迟给药或提前中止疗程,为进一步提高地西他滨的疗效,我们探索出一套分段治疗及疗效评估体系,现对该体系做一详细说明,并同传统地西他滨治疗体系进行比较分析。研究目的：论证研究地西他滨分段治疗及疗效评估体系的合理性、可行性及安全性,分析比较地西他滨传统治疗体系与分段治疗评估体系治疗骨髓增生异常综合征的有效性。研究方法：研究对象选择山东大学齐鲁医院2012年2月至2013年12月确诊为MDS的57例患者。24例患者接受传统小剂量地西他滨治疗方案：应用地西他滨20m/平方米/天,静脉输注,连续5天,4周一疗程。在地西他滨治疗第2疗程后复查骨髓细胞学和外周血象,评价骨髓和血液学缓解情况,评估疗效。33位MDS患者接受小剂量地西他滨分段治疗及疗效评估体系治疗：用药剂量同前；首次应用地西他滨前根据MDS患者基线特征评估情况,加强支持治疗,并同时进行抗微生物“三联”预防。治疗第2疗程完后监测血小板计数变化情况,第3疗程后复查骨髓原始细胞数、外周血象,评估疗效。第4疗程后进行巩固治疗,第6疗程后进入维持治疗。第1疗程后,统计分析传统治疗组和分段治疗评估组两组之间在3-4级血液学副反应及感染发生率方面有无差异,分析比较两组之间在延迟给药发生率、提前中止治疗发生率等方面有无差异；第2疗程结束后重点关注血小板变化情况,动态监测血小板数目,分析比较两组中血小板改善情况；第3疗程后分段治疗评估组进行骨髓原始细胞数和外周血象复查,传统治疗组已在第2疗程后复查骨髓原始细胞数和外周血象,统计分析两组中地西他滨治疗的总有效率(overallresponserate,ORR)是否存在统计学差异,ORR评价指标包括完全缓解(completeremission,CR)率和部分缓解(partialremission,PR)率。比较两组输血依赖情况及地西他滨中位疗程数有无统计学差异。研究结果：1.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系第一疗程后发生感染的情况传统治疗组地西他滨应用第一疗程后发生感染的机率为66.7%,分段治疗组第一疗程后发生感染的机率为39.4%,P=0.042<0.05,传统治疗组与分段治疗组MDS患者并发感染的机率具有统计学差异。2.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系第一疗程后发生3～4级中性粒细胞减少的情况传统治疗组不良反应-3-4级中性粒细胞减少的发生率为33.3%,分段治疗组3-4级中性粒细胞减少的发生率为9.1%,P＝0.039<0.05,分段治疗组和传统治疗组3-4级中性粒细胞减少发生率具有显著统计学差异。3.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系第一疗程后发生3-4级血小板减少的情况传统治疗组不良反应3-4级血小板减少的发生率为50.0%,分段治疗组3-4级血小板减少的发生率为24.2%,P=0.044<0.05,说明分段治疗组和传统治疗组3～4级血小板减少发生率具有显著统计学差异。4.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系第一疗程后发生3-4级贫血的情况传统治疗组不良反应3～4级贫血的发生率为29.2%,分段治疗组3-4级贫血的发生率为6.1%,P=0.027<0.05,说明分段治疗组和传统治疗组3～4级贫血发生率具有统计学差异。5.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系一疗程后延迟给药和中止治疗的发生情况传统治疗组地西他滨应用一疗程后延迟给药发生率为66.7%,分段治疗组治疗过程中延迟给药发生率为36.4%,P=0.024<0.05,说明分段治疗组和传统治疗组地西他滨应用一疗程后延迟给药发生率具有统计学差异。一疗程后中止治疗的发生率没有统计学差异。6.地西他滨传统治疗体系和分段治疗评估体系治疗反应的对比传统治疗组及分段治疗组地西他滨的总有效率ORR(CR%+PR%)分别为12.5%和36.4%,P=0.043<0.05,分段治疗及疗效评估体系可以显著提高地西他滨治疗的有效率。传统治疗组血小板改善率为41.7%,分段治疗组血小板改善率为69.7%,P=0.034<0.05,分段治疗组和传统治疗组MDS患者获得血小板改善的机率具有显著统计学差异,分段治疗及疗效评估体系中MDS患者的血小板反应更佳。传统治疗组和分段治疗组两组中MDS患者的血小板数目均比其自身的中性粒细胞数目和血红蛋白含量恢复得早。分段治疗组获得血小板改善的MDS患者其血小板计数水平多在第2-3疗程开始回升,而传统治疗组获得血小板改善的MDS患者其血小板计数水平常在第3、4疗程开始回升。在地西他滨传统治疗组中,治疗前输血依赖者13例,治疗后输血依赖者9例,脱离输血依赖患者的比例为30.8%。在地西他滨分段治疗组中,治疗前输血依赖者24例,治疗后输血依赖者8例,脱离输血依赖患者的比例为66.7%,P=0.036,分段治疗评估体系中更高比例的患者脱离输血依赖,输血频次或输血量较大幅度地减低。7.传统治疗体系和分段治疗评估体系地西他滨中位疗程数对比传统治疗组MDS患者使用地西他滨治疗的疗程数是1-5,中位疗程数是4；分段治疗组MDS患者使用地西他滨治疗的疗程数是2-8,中位疗程数是7。比较两组之间中位疗程数的差异,P<0.01,提示分段治疗及疗效评估体系可以确保地西他滨疗程的衔接性。结论：与地西他滨传统治疗MDS相比,在分段治疗及疗效评估体系的各个环节中我们进行了“三联”预防微生物感染,降低了感染率；及时应用造血生长因子或成分输血促进血液学恢复,降低了延迟或减量给药的发生率；分时段科学监测患者外周血和骨髓的耐受情况及恢复水平。地西他滨分段治疗骨髓增生异常综合征及疗效评估体系可以确保去甲基化治疗的连续性及足够的疗程数,减少血液学不良反应及继发感染的机会,减少延迟给药和输血依赖的发生,最终提高初治或其他治疗无效的MDS患者的总体反应率。
【作者】邵琳琳；
【导师】侯明；
【作者基本信息】山东大学，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】骨髓增生异常综合征；Th22细胞；Th17细胞；炎症免疫；免疫逃逸；DNA甲基化；地西他滨；分段治疗及疗效评估体系；

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