肠道病毒分子流行病学及肠道病毒71型感染致炎症反应机制研究

【摘要】肠道病毒71型（EV71）是导致手足口病重症病例的重要病原体之一，具有明显的嗜神经性，可导致脑炎、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脑脊髓炎、脊髓灰质炎样综合征等神经系统病变。EV71于1969年首次在美国加州患有神经系统疾病的新生儿粪便标本中分离出来，此后在欧亚国家及我国全国范围内广泛流行，累及我国各省、市和自治区。规模较大、较为严重的一次为1998年在台湾爆发的EV71流行，在该次流行中，共有405例重症患儿，其中78例死亡，死亡率占重症患者的19.2%。据卫生部统计，2012年，全国手足口病患病人数已达到2168737人，死亡567人。其死亡原因主要由于EV71感染引发中枢神经系统炎症反应并导致肺水肿、心肌炎等并发症，但其致炎症反应发生机制目前还不明确。在治疗方面，尚缺乏特异、高效的抗病毒药物，抑制炎症反应和对症治疗是主要治疗措施。在EV71感染的临床治疗中，糖皮质激素常被用于抑制神经的炎症反应，但其对机体全身性的免疫抑制，具有较大的毒副作用并可导致病毒感染扩散，易引起继发性细菌感染等严重不良反应。因此，为应对EV71的流行及降低死亡率，充分认识EV71感染导致的神经系统炎症反应机制显得极为重要。利用流行病学和分子流行病学对河南无菌性脑膜炎疫情和山东临沂手足口病疫情进行分析。引起河南无菌性脑膜炎疫情的病原体为柯萨奇B5病毒，系统进化分析显示该病毒属于E亚型，重症分离株在进化上形成一单独分支，VP1区95位点氨基酸可能为CVB5病毒重要的毒力决定簇。引起山东临沂手足口病疫情的病原体为肠道病毒71型，系统进化分析显示该病毒属于C4亚型，此次疫情毒株由3条传播链进行传播，重症分离株与轻症分离株在VP1区145位氨基酸差异显著，说明该位点可能为EV71病毒重要的毒力决定簇。肠道病毒引起的手足口病在国内广泛流行，对婴幼儿的身体健康带来严重威胁。通过对肠道病毒流行的大量监测，我们发现基因变异促进了病毒毒力增强，从而加重了感染所引起的症状。然而，EV71致病机制目前尚不十分清楚，致病机制研究还处于摸索阶段。EV71在国内流行主要以C4亚型为主，而C4亚型对动物敏感性低，感染动物模型极不易构建，为研究C4亚型的致病机制带来了阻碍。为应对国内EV71感染的严峻形势，我们利用EV71C4亚型毒株（AH08/06）建立感染小鼠致炎症反应模型，以此来研究EV71感染致炎机制，为有效控制EV71感染，开发特异性抗病毒药物和疫苗开拓新思路。首先，我们对EV71感染小鼠模型生存、体征情况进行观察。腹腔注射EV71病毒（10-7TCID50）感染1日龄昆明小鼠，小鼠感染后会出现消瘦、震颤、颈部僵硬、抽搐、肢体瘫痪等典型发病症状。感染组小鼠从第4天开始陆续出现死亡，第6天全部死亡。感染组从第2天开始，体重增长趋于平缓，直到第6天全部死亡为止，感染组第3-6天体重显著低于空白对照组（P<0.05）。感染组小鼠从第3天开始活动力明显降低，第4天出现后肢瘫痪，第6天不能活动、无法进食、呼吸衰竭。感染后3-6天出现定向障碍。没有出现皮肤出疹的情况。从生存率上可以看出AH08/06株对小鼠极为敏感，属于鼠适应株。在体征上，本模型基本符合人感染EV71重症症状，适合进一步开展致病机制研究。为了解小鼠体内感染EV71的分布情况以及EV71在体内的传播方式，我们采用实时定量PCR、组织病毒滴度测定、免疫组织化学等技术手段对EV71感染小鼠1-6天的血、脑、肺、小肠、后肢肌肉、肝、脾、肾等组织器官病毒时空分布进行测定。结果显示，在时间顺序上，小鼠感染1天后仅在血中检测到病毒，小肠、肺、骨骼肌、脊髓在感染2天后可检测到病毒，脑是最后检测出病毒的组织，肝、肾、脾均没有发现病毒感染。在感染病毒累积量上，血液在整个感染过程中病毒滴度比较平缓，说明感染造成了持续的病毒血症；骨骼肌内病毒滴度明显高于其它组织，说明骨骼肌是EV71复制的最主要靶器官；脑和脊髓感染的病毒量仅次于骨骼肌，也是EV71攻击的主要靶器官，另外，免疫组化结果显示，EV71在中枢神经系统仅感染脑干和脊髓的神经元；小肠和肺感染量最低。根据以上结果，我们可以推测出EV71在体内以两种方式进行传播：首先，病毒进入腹腔后，可能通过淋巴组织迅速进入血液，同时感染小肠，随后病毒随血液传播到骨骼肌、肺等靶组织感染并在其内复制。其次，在感染时间上脊髓要先于脑，而脑的感染时间要滞后于其它组织器官，同时免疫组化结果显示EV71感染脑部仅能感染脑干部位，这说明EV71进入脑是从脊髓传播而来，因此EV71进入脑部可能是按照从外周神经到脊髓再到脑的神经通路进行传播。为了解EV71感染对组织的损伤程度，我们利用HE染色对EV71感染小鼠各器官进行组织病理学检测。EV71感染小鼠脑部仅脑干检测到病毒感染，脑干受损伤神经元附近出现大量的单核细胞浸润现象，多发性增生的胶质细胞聚集形成胶质小结；部分神经元显著肿胀、变性、坏死，噬神经细胞现象明显；小血管周围出现袖套样炎性细胞浸润，以单核、淋巴细胞为主及少量中性粒细胞，说明脑干发生了剧烈的炎症反应。骨骼肌内发生明显的肌纤维断裂，出现大量的炎性细胞，造成严重的坏死性肌炎。小肠感染后并没有发生明显的病理变化，说明小肠对机体免疫反应的耐受作用要明显大于其它组织。心脏出现灶性收缩带坏死，血管淤血、部分管腔单核、淋巴细胞比例增高。肺部支气管壁炎性细胞浸润，肺泡壁增宽伴数量不等的单核细胞、淋巴细胞浸润，部分肺泡不张、实变，或肺泡腔见较多巨噬细胞及多核巨细胞。肝脏局部出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润细胞。脾中性粒细胞浸润，脾窦淤血。肾小球附近及肾盂出现炎性细胞浸润。以上结果显示，脑干、脊髓等中枢神经系统损伤严重，EV71嗜神经现象明显，出现严重的脑干脑炎和脑脊髓炎，与人感染EV71死亡病例脑干炎症损伤情况极为相似，因此这可能成为EV71感染小鼠致死的最主要原因。骨骼肌、肺、肝、脾、肾等多器官系统性炎症反应，进一步加速了感染小鼠的死亡。为了解EV71感染对器官功能的损伤程度，我们对EV71感染小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等肝肾功能指标进行测定，发现ALT、AST、BUN在感染末期发生明显改变，说明在感染后期肝肾功能发生异常。组织病毒检测并没有在肝肾发现EV71感染，但病理学检查显示肝肾在感染后期均出现不同程度的炎症反应，从而导致肝肾功能发生异常。因此，可以推测肝肾损伤可能由神经或免疫调节紊乱导致，同时肝肾功能失调也会加速感染小鼠的死亡，这将有助于我们进一步了解EV71感染引起的神经和免疫调节机制。为研究EV71感染小鼠炎症发生机制，我们对EV71感染小鼠血清31种细胞因子进行流氏细胞测定，发现G-CSF、IL-1α、IL-6、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1β、RANTES、IFN-γ、TNF-α等10种因子在EV71感染过程中发生明显变化，说明EV71感染引起体内细胞因子风暴产生。细胞因子在抗病毒反应、参与炎症反应、调节免疫方面具有重要作用。IL-6、IFN-γ、IP-10、MIP-1β和TNF-α是参与炎症反应主要因子，其水平大幅升高，说明EV71感染小鼠体内发生剧烈炎症反应，同时这些因子已成为预测EV71感染重症的标志检测物。细胞因子风暴的产生不仅能保护机体防御病毒入侵，还能严重地影响了机体的免疫耐受作用，也是引起EV71重症、死亡病例的重要原因。因此，EV71感染小鼠细胞因子变化水平，进一步阐明了机体在EV71感染过程中的免疫调节机制，对降低EV71感染重症患者的病死率有重要意义。综合国内外研究结果以及我们动物实验结果，脑部炎性损伤是EV71感染重症及死亡的主要原因。因此，我们重点关注EV71感染小鼠脑部炎性损伤机制。而补体系统是炎症反应发生的中心，在H1N1流感等病毒的致炎机制中起关键作用。因此，本研究也重点关注补体系统在EV71脑部炎性损伤中所起的作用。通过对补体C3d蛋白免疫组化分析显示，EV71感染小鼠脑干和肌肉炎症反应发生部位部位出现C3d沉积，这表明补体系统激活。Westernblot结果显示，脑部补体C3d蛋白在感染前期和后期大量表达，推测补体系统以两种不同激活途径参与抗病毒和炎症反应。补体抑制因子DAF和CD59mRNA表达量由前期升高迅速转为下降，表明在EV71感染小鼠过程，补体系统在感染前期参与了抗病毒反应和趋化炎症因子反应，而后期补体系统由于补体调控分子的抑制作用下降，直接导致机体的耐受力下降，结合补体大量激活，从而加剧了炎症反应的程度，其产生的MAC也对机体正常组织产生伤害。由此，我们可以推测，补体在EV71感染至炎症反应和机体耐受力方面可能起到了至关重要的作用。有文献报道miRNA在神经系统疾病和免疫调节方面起重要的调控作用。在分子水平上，我们对miRNA对EV71感染小鼠致脑部炎症反应调控机制进行了初步研究。利用miRNA芯片对EV71感染3天和6天的小鼠miRNA表达谱进行了检测。在EV71感染小鼠脑中共检测出398条microRNA。感染3天的microRNA表达谱明显不同于感染6天。感染3天与对照3天microRNA表达差异不明显，而感染6天与对照6天的microRNA表达出现较大差异。因此，在EV71感染小鼠过程中，microRNA表达随时间变化。EV71感染后3天，感染组仅有2个miRNA发生下调，而感染后6天，感染组有38个miRNA发生下调，22个miRNA发生上调。这表明EV71感染小鼠中枢神经系统过程中，miRNA发挥了调控作用。对差异表达miRNA预测靶标进行GO分析和pathway分析，发现差异表达的miRNA对轴突导向通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、神经生长因子通路等神经活动、免疫调节途径调控作用明显，这表明脑内miRNA参与了EV71感染中枢神经系统炎症反应的调控，为深入了解EV71感染致炎机制提供分子基础。综合上述研究内容，本研究对肠道病毒感染引起的疫情进行流行病学和分子流行病学调查，分析肠道病毒基因的变异进化规律，为手足口病防控提供科学依据。本研究通过EV71感染致炎症反应小鼠模型，确定EV71可感染脑、脊髓、骨骼肌、肺、小肠等多组织器官并造成炎症反应和功能障碍，推断EV71在小鼠体内可能通过血液和神经两种途径进行传播，细胞因子和补体在炎症反应和机体耐受方面起重要作用，并在分子水平上初步确定miRNA参与了EV71感染小鼠中枢神经系统炎症反应的调控。本研究为EV71感染小鼠致炎症反应机制提供了重要数据，也为研制EV71病毒疫苗和抗病毒药物提供了分子靶标，有助于深入阐述EV71感染宿主致病机制。
【作者】柳楠；
【导师】宋宏彬；邱少富；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，免疫学，2014，博士
【关键词】肠道病毒71型；炎症；致病机制；病毒分布；微小RNA；

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