记忆性CD8~+T细胞在同种器官移植急性排斥反应中的作用及机制研究

【摘要】在器官移植中,免疫排斥反应严重威胁移植器官的存活。效应性T细胞是机体发生免疫排斥时的主要效应细胞,临床应用的免疫抑制剂大多通过抑制效应性T细胞达到延长移植器官存活的目的。然而目前对于记忆性CD8+T细胞是否在移植器官的排斥反应中发挥作用尚无定论。本课题针对记忆性CD8+T细胞在同种器官移植中的作用及机制进行了相关研究,主要分三部分进行阐述。第一部分小鼠腹腔异位心脏移植模型的建立摘要日的：探索建立BALB/c小鼠腹腔异位心脏移植模型的方法。方法：将BALB/c小鼠60只作为受体,C57BL/6小鼠60只作为供体。供体心脏移植于受体小鼠腹部,供体心脏的升主动脉、肺动脉分别与受体小鼠腹主动脉、下腔静脉在显微镜下行端侧吻合。结果：实施BALB/c小鼠腹腔异位心脏移植60例,手术成功49例,失败11例,成功率81.7%。失败原因分别为失血过多、静脉回流不畅、下肢瘫痪、麻醉过深。结论：成功建立小鼠腹腔异位心脏移植模型,建立该心脏移植模型对术者操作要求较高,经过系统练习后可达到较高的成功率,该模型的建立为进一步研究器官移植免疫耐受提供了可靠的基础。第二部分小鼠记忆性CD8+T细胞的诱导产生及其纯化、鉴定摘要目的:探讨如何诱导、分离并纯化BALB/c小鼠的记忆性CD8+T细胞,并初步建立追踪记忆性CD8+T细胞在体内分布的方法。方法：60只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组小鼠背部接受C57BL/6小鼠皮片移植,对照组小鼠未进行皮肤移植,3个月后取脾脏,应用磁性细胞分离技术分选提纯记忆性CD8‘T细胞和未致敏性CD8+T细胞,并用流式细胞仪检测两类细胞表面标志物；使用DiR染料对记忆性CD8+T细胞进行标记,并将其经过尾静脉输注入小鼠体内,通过活体成像仪观察受体小鼠体内荧光的分布情况,进而观察记忆性CD8+T细胞在体内的分布情况。结果：通过磁性细胞分选方法成功从小鼠脾细胞中纯化出记忆性CD+T细胞及未致敏CD8+T细胞,细胞纯度分别达到96.4%及96.3%；DiR标记的记忆性CD8’T细胞经尾静脉输注到小鼠体内后主要集中于小鼠的肝脏及脾脏。结论：通过磁性细胞分选方法可成功提取纯化高纯度的记忆性CD8+T细胞及未致敏CD8+T细胞：通过活体成像仪可成功观察到DiR标记的记忆性CD8+T细胞在体内的分布,初步建立起记忆性CD8+T细胞体内示踪的方法。第三部分记忆性CD8+T细胞在小鼠腹腔异位心脏移植急性排斥反应中的作用及其机制的研究摘要目的：探索记忆性CD8+T细胞对BALB/c小鼠腹腔异位心脏移植的影响及其可能的影响机制。方法：作为受体的36只BALB/c小鼠随机分成3组,记忆性CD8+T细胞组(实验组,n=12)：输注记忆性CD8+T细胞。未致敏CD8+T细胞组(对照组,n=12)：输注未致敏CD8+T细胞。空白对照组(n=12)：未输注T细胞。C57BL/6小鼠作为供体,在细胞输注后3周时行心脏移植,所有受体小鼠在移植前1天至移植心脏停跳期间腹腔注射环孢素A(5mg/kg/d)。检测指标为比较3组小鼠异体心脏移植的存活时间及移植心脏急性排斥反应的组织学分级；通过流式细胞仪检测并比较各组小鼠脾脏及供体心脏中记忆性CD8+T细胞比例；通过ELISA法检测各组小鼠血清中IFN-γ及CXCL-9含量；通过RFQ-PCR测定异体移植心脏中TGF-β、IFN-γ及IL-2含量。结果：实验组小鼠腹腔异位心脏存活时间明显低于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组小鼠腹腔异位心脏的存活时间低于空白对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)；实验组小鼠腹腔异位心脏的组织学分级评分明显高于对照组和空白对照组(P<0.05),对照组和空白对照组小鼠供体心脏的组织学分级评分无明显差异(P>0.05)；心脏移植术后第3天实验组小鼠脾脏中记忆性CD8+T细胞比例明显低于对照组与空白对照组,而实验组小鼠供体心脏中记忆性CD8+T细胞比例明显高于对照组与空自对照组；实验组小鼠血清中IFN-γ、CXCL-9含量明显高于对照组及空白对照组(P<0.05),对照组与空白对照组之间无明显差异(P>0.05)；实验组小鼠供体心脏中TGF-β含量明显低于对照组、空白对照组(P<0.05),而IFN-Y及IL-2含量明显高于对照组、空白对照组(P<0.05)。结论：当记忆CD8+T细胞再次接触同种异体移植心脏时可引起急性排斥反应,并月.应用环胞霉素A并不能抑制该排斥反应的发生。当记忆CD8+T细胞再次接触同种异体抗原时可使CXCL-9趋化因子水平升高,使得炎症局部记忆性CD8+T细胞增多,并通过产生IL-2及IFN-γ等炎症因子促使移植物发生急性排斥反应。
【作者】杜刚；
【导师】赵永祥；
【作者基本信息】广西医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】小鼠；心脏移植；腹腔异位移植；动物模型；皮肤移植；记忆性CD8~+T细胞；未致敏CD8~+T细胞；磁性细胞分离技术；记忆性CD8~8T细胞；腹腔异位心脏移植；急性排斥反应；细胞因子；趋化因子；

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