生长抑制特异蛋白GAS2在慢性粒细胞白血病中异常高表达的生物学意义研究

【摘要】目的：研究生长抑制特异蛋白GAS2在慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）细胞中的表达与功能，并初步探讨其作用机制。方法：（1）使用密度梯度离心获取CML患者和健康供体骨髓中的单个核细胞，使用CD34细胞磁珠富集试剂盒纯化CD34+细胞，并使用FACS纯化lin-CD34+和lin-CD34+CD38-细胞。Q-RT-PCR方法检测各类细胞中的GAS2转录本表达，免疫荧光的方法检测CD34+细胞中GAS2蛋白的表达。（2）制备携带靶向GAS2的shRNA的慢病毒，并侵染CML细胞株（K562和MEG-01）以及患者的CD34+细胞，检测GAS2沉默与对照细胞的Calpain活性、生长和集落生成能力。（3）使用PCR的方式扩增GAS2DN（GAS2△171-313，GAS2的显性负性突变体），并克隆至慢病毒载体中。在CML细胞株（K562和MEG-01）以及患者的CD34+细胞中过表达GAS2DN，而后检测GAS2DN与对照细胞的Calpain活性、生长及集落生成能力。（4）使用伊马替尼（Imatinibmesylate，IM）敏感的K562细胞研究GAS2沉默和GAS2DN表达对细胞IM敏感性的影响。（5）使用MEG-01细胞研究GAS2DN对细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。（6）使用免疫共沉淀研究GAS2与Calpain2在白血病细胞中是否存在相互结合。在GAS2DN过表达的细胞中利用RNAi抑制Calpain2的表达，以研究Calpain2活性的变化在GAS2DN影响CML细胞生长中的作用。（7）使用TOPFlash/FOPFlash报告基因质粒研究GAS2沉默及GAS2DN对CML细胞中β-catenin转录活性的影响；也使用免疫印迹等方法研究GAS2沉默及GAS2DN对CML细胞中β-catenin表达和定位的影响。（8）建立GAS2DN表达及对照MEG-01细胞的基因表达谱数据，并通过与公共数据库中CML相关数据的对比研究靶向GAS2影响CML细胞生长的分子机制。（9）使用Q-RT-PCR和免疫印迹等方法验证响应GAS2DN表达的候选基因，并使用基因沉默的方式研究候选基因HNRPDL在CML细胞生长的功能。结果：GAS2的mRNA表达在CML来源的细胞中均较健康供体来源细胞显著增高；免疫荧光显示GAS2蛋白在患者CD34+细胞中的表达也较正常对照细胞增高。使用两条独立的shRNA序列能有效抑制CML细胞中的GAS2表达，并导致GAS2蛋白表达的降低并活化细胞中的Calpain。GAS2沉默使CML细胞株（K562和MEG-01）和患者CD34+细胞的生长及集落生成能力显著降低。我们成功克隆了GAS2DN（GAS2△171-313，GAS2的显性负性突变体），并使用慢病毒递送至CML细胞中。这导致细胞中Calpain活性的增高并使它们的生长及集落生成能力显著降低。有趣的是，我们发现GAS2DN抑制CML患者CD34+细胞集落生成的能力显著强于它对健康供体来源CD34+细胞的抑制。GAS2沉默和表达GAS2DN都能增强K562细胞的IM敏感性。GAS2DN也显著抑制了MEG-01细胞在裸鼠皮下成瘤的能力（对照组：10/12，约83%；GAS2DN组：3/10，30%）；且减缓肿瘤细胞的生长速度。免疫共沉淀表明GAS2与Calpain2在白血病细胞中相互结合。使用Calpain2的RNAi能显著“挽救”GAS2DN所导致的CML细胞生长抑制。我们发现K562和MEG-01细胞不具有β-catenin的转录活性，靶向GAS2不影响β-catenin的表达及定位。为研究靶向GAS2抑制CML细胞生长的分子机制，我们建立了表达GAS2DN和对照MEG-01细胞的基因表达谱。通过与公共数据库中相关数据的对比及表达验证，我们发现GAS2DN能显著抑制HNRPDL、PTK7和UCHL5的表达，而这3个基因在CML的单个核细胞和CD34+细胞中的表达均较正常对照细胞显著升高。在K562细胞中沉默HNRPDL能显著抑制细胞的生长及集落生成能力，并增强其IM敏感性。结论：CML与健康供体骨髓细胞相比，GAS2的转录本和蛋白表达均显著升高。沉默GAS2或者表达GAS2DN能显著抑制CML细胞的体外生长、集落生成能力和裸鼠皮下成瘤能力。此外，GAS2DN抑制患者CD34+细胞的能力强于它抑制正常骨髓CD34+细胞的能力，表明该抑制作用具有一定的特异性。最后，靶向GAS2增强CML细胞的IM敏感性。靶向GAS2的生长抑制作用依赖Calpain的活化，但不依赖β-catenin降解；可能通过下调一组（包括HNRPDL）基因的表达而实现其生长抑制功能。综上，本论文的研究表明GAS2在CML细胞中异常高表达，是CML细胞生长的新调控因子；提示GAS2可能成为改善CML治疗的新靶点。
【作者】周海侠；
【导师】吴德沛；赵昀；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，博士
【关键词】GAS2；Calpain；慢性粒细胞白血病；CD34；伊马替尼；

【参考文献】
[1]李泽伟.CuAlNi马氏体相变波场数值模拟[D].哈尔滨工业大学,固体力学,2013,硕士.
[2]张路路.提高亚麻粗纱可纺性的脱胶漂白工艺研究[D].苏州大学,纺织化学与染整工程,2013,硕士.
[3]李必强,胡浩.系统集成数据仓库与模糊群决策理论的决策支持系统[J].武汉理工大学学报(信息与管理工程版),2004,06:21-23.
[4]张绍苇.基于PLC和Qt的层压监控系统设计与实现[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2014,硕士.
[5]周立.超支化聚缩水甘油基无机纳米复合材料的制备及应用研究[D].湖南大学,2010.
[6]王一木,潘赟,龙彦辰,严晓浪,宦若虹.基于自组织映射的手写数字识别的并行实现[J].浙江大学学报(工学版),2014,04:742-747.
[7]刘晓荣.旋—射流式干燥器的设计与实验研究[D].中南林业科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[8]高欣.CNQC公司国际事业本部绩效管理体系优化设计[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[9]陈晓晨.主生产计划在ERP-U9系统中的应用[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[10]汪银峰.《元韵谱》研究[D].吉林大学,历史文献学,2004,硕士.
[11]王艳.多因素干预促进视神经再生的实验研究及视神经缺血模型的建立[D].复旦大学,眼科学,2012,博士.
[12]徐祎.拼接在服装设计中的应用[D].北京服装学院,设计艺术学,2012,硕士.
[13]李秀梅.非严格双曲守恒律的黎曼解在自相似粘性下稳定性分析[D].鲁东大学,应用数学,2014,硕士.
[14]武璐璐.河南焦作地区回族小学整体教育环境的调查研究[D].渤海大学,小学教育（专业学位）,2014,硕士.
[15]雷振华.惠农政策效能分析与政策完善研究[D].湖南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[16]韩杨.市场规制法视域下的企业法律规制[D].山东大学,民商法学,2013,硕士.
[17]高程.第三系软弱围岩地下水环境效应研究[D].西南交通大学,环境工程,2013,硕士.
[18]王旬果.循证医学与三维适形放疗在恶性肿瘤治疗中的临床研究[D].青岛大学,肿瘤学,2003,硕士.
[19]牛怀成,李利春,李瑛,韩文峰,唐浩东,刘化章.高比表面积氟化镁的合成及其在催化中的应用研究进展[J].化工进展,2012,07:1484-1492.
[20]裴东慧.重庆市金融产业集聚对区域经济增长的影响研究[D].重庆工商大学,区域经济学,2014,硕士.
[21]刘旺盛,杨帆,李茂青,陈培芝.需求可拆分车辆路径问题的聚类求解算法[J].控制与决策,2012,04:535-541.
[22]李普曼.康德对优美与崇高概念的两种规定及其意义[D].浙江大学,美学,2013,硕士.
[23]卢锦熙.灵芝孢子油化学成分研究[D].广州中医药大学,药剂学,2013,硕士.
[24]宣诚.后金融危机时代美国货币政策对中国股市溢出效应实证研究[D].复旦大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[25]苑全玺.IMF援助效果的国际政治经济学分析[D].中共中央党校,外交学,2014,博士.
[26]钦晓双.中国工业行业资本存量测算[D].南京大学,数量经济学,2013,硕士.
[27]程日升.语境理论在大学体育专业英语口语教学中的应用研究[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[28]杭小树,张友华,袁红春,黄河,熊范纶.一个综合知识发现与知识求精系统——XFKDRS[J].模式识别与人工智能,2002,03:334-338.
[29]刘宁.煤矸石泡沫混凝土研究[D].长安大学,材料学,2013,硕士.
[30]胡宾.基于无线通讯网络的心电远程监护系统研究[D].天津大学,生物医学工程,2003,硕士.
[31]梁莉莉.基于侧面碰撞性能的AA7075车身结构件研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[32]孙宝传.关于媒体资产管理的初步调研[J].中国传媒科技,2005,08:55-57.
[33]曹恒.社会管理视域下的政治体制改革[D].东北师范大学,政治学理论,2012,硕士.
[34]蒙艳丽.雷公藤醇提液瘤体内注射对小鼠移植性肿瘤的抑制作用研究[D].黑龙江中医药大学,中西医结合基础,2004,硕士.
[35]雍学善,余建平,石兰亭.一种三维高精度储层参数反演方法[J].石油地球物理勘探,1997,06:852-856+890.
[36]杜军妍.骨再造阈值与几个细胞通路定量关系研究[D].哈尔滨工业大学,力学,2013,硕士.
[37]向梦瑶.苏联解体后的俄语缩略词问题探究[D].广东外语外贸大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[38]闵宗军.混合结构T型墙梁半刚接耗能节点构造及受力性能研究[D].北京建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[39]王同建,胡静波,瞿爱琴,张子达.装载机线控转向系统硬件在线回路仿真[J].农业机械学报.2007(10)
[40]孙姗姗.基于活动轮廓模型和闭合形式的图像分割方法研究[D].安徽大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[41]本报记者曹术华.得客户者得天下[N].中国计算机报,2001-12-17E10.
[42]吴砚.以社会主义核心价值体系引领大同城市文化建设[D].山西师范大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[43]朱创录.基于ZigBee网络的渭南智慧农业平台关键技术研究[J].渭南师范学院学报,2014,19:39-43.
[44]顾亚静.铁路旅客站站房规模基础参数研究[D].武汉理工大学,建筑与土木工程,2012,硕士.
[45]文亚俊.基于移动端的电子商城虚拟展示及漫游平台设计研究[D].哈尔滨工业大学,设计学,2014,硕士.
[46]杨白.LPS移动基于胜任力的人才选拔[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[47]康文欣.肉制品和饲料中鸭源性成分PCR鉴别方法标准化研究[D].吉林大学,生物工程,2014,硕士.
[48]郑慧琳.鸡-β防御素-1，6基因工程菌的构建及表达制备[D].东华大学,生物化工,2012,硕士.
[49]杜欣娥.乙酰肝素酶的原核表达及其单克隆抗体的制备[D].广东药学院,药剂学,2012,硕士.
[50]石韬伟.混合动力型列车动力学及环境可行性研究[D].北京交通大学,2014.