L-色氨酸工程菌的改造及发酵条件控制

【摘要】色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，在医药行业、食品行业以及动物饲料等行业的应用非常广泛。目前，世界市场对色氨酸的需求量每年都在万吨以上，其增长速率呈逐年上升趋势，因此L-色氨酸的市场空间巨大。目前由于大肠杆菌的遗传背景比较清晰，而且其具有改造方便，发酵周期短等优点，因此大肠杆菌已经成为发酵生产L-色氨酸的重要微生物。本文以大肠杆菌(Escherichiacoli)JLTRP为出发菌株，通过基因敲除手段构建生物合成L-色氨酸的基因工程菌，分别探究丙酮酸脱氢酶基因(poxB)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)缺失及丙酮酸脱氢酶基因、磷酸转乙酰基酶基因、乳酸脱氢酶基因(ldh)缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响。完成的主要工作有：(1)利用对二甲基苯甲醛比色法对L-色氨酸含量进行初步测量，在此基础上绘制出L-色氨酸标准曲线，得到回归方程：y=0.3893x+0.0061，相关系数R2=0.9972；利用高效液相色谱（HPLC）对色氨酸含量进行定量分析，绘制出L-色氨酸标准曲线，得到回归方程：y=34.102x+0.214，相关系数R2=0.9998。(2)利用P1噬菌体一步敲除的方法敲除了EscherichiacoliJLTRP菌株的磷酸转乙酰基酶基因、丙酮酸脱氢酶基因构建基因工程菌E.coliBZ007；敲除了E.coliJLTRP菌株磷酸转乙酰基酶基因、丙酮酸脱氢酶基因、乳酸脱氢酶基因构建工程菌E.coliBZ010。通过摇瓶发酵筛选出L-色氨酸产量较高的菌株。(3)采用5L发酵罐对基因工程菌E.coliBZ007和E.coliBZ010菌株进行扩大培养，种子培养液中的葡萄糖初始浓度维持在40g/L，培养过程中培养液葡萄糖浓度接近零，种子培养基中OD600达到12-14，种子培养过程结束。(4)将2L种子发酵液接种到装有14L初始发酵液的30L发酵罐中进行补料分批发酵试验。在最佳培养条件下，菌种E.coliBZ007和E.coliBZ010的L-色氨酸最高产量分别达到33.5g/L和18.5g/L。研究结果表明poxB、pta基因的敲除有利于色氨酸的积累；poxB、pta、ldh基因的敲除影响菌体的正常生长，可能是与其他因素相关，有待进一步研究发现。
【作者】郭宝珠；
【导师】王健；
【作者基本信息】吉林大学，发酵工程，2014，硕士
【关键词】大肠杆菌；色氨酸；磷酸转乙酰基酶基因；丙酮酸脱氢酶基因；乳酸脱氢酶基因；发酵；

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