用于耐药性肿瘤治疗的药物-Pluronic键合物混合胶束系统的研究

【摘要】肿瘤的多药耐药性(Multidrugresistance,MDR)是临床上化疗失败的主要原因之一。迄今,许多抗肿瘤药物如紫杉烷类、长春碱类和蒽醌类等,在临床上都出现了多药耐药性。目前,开发具有逆转MDR活性的Pluronic胶束递药系统成为治疗耐药性肿瘤的一种新思路。但普通胶束的载药量低,对耐药肿瘤的体内作用仍不理想。本课题首先选用极易耐药的甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)为模型药物,构建了以药物-载体键合物(Polymer-drugconjugates)方式载药的混合胶束(Chemicalconjugationofdruginmixedmicelles),使胶束的载药量和体内外抗MDR肿瘤药效明显提高。在研究中发现,可以直接将亲水性药物键合于胶束的载体材料上,同时胶束的疏水内核还可以包载难溶性药物,通过两种载药方式结合可以实现水溶性和疏水性药物的联合给药,进一步提高胶束载药量,发挥药物协同作用的优势。为进一步验证这一构想,选用临床常用的联用药物阿霉素(doxorubicin,DOX)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)为模型药物,构建双载药混合胶束系统；并将高靶向性的c(RGDyK)肽修饰在混合胶束中F127的PEO链上,通过肿瘤新生血管内皮细胞和MDR肿瘤细胞高表达的整合素αvβ3受体介导,增加药物在肿瘤部位的渗透和蓄积能力,抑制肿瘤新生血管的生成,提高对耐药肿瘤的治疗作用。本文第一部分中,合成了MTX与PluronicP105的键合物P105-MTX,并与F127制备混合胶束F127/P105-MTX;以及PluronicP105/F127物理包载MTX的混合胶束PF-MTX,并以胶束的载药量,包封率和粒径为考察指标,筛选出了PF-MTX的较优处方。结果显示,PF-MTX的较优处方为P105、F127和MTX的比例为266.7mg:33.3mg:10mg,制备的PF-MTX粒径为22nm；F127/P105-MTX的载药量为PF-MTX的3.3倍,粒径增大,约为100nm,形态圆整,大小均一。DSC分析表明MTX以无定形分子或固态溶液形式分散在共聚物骨架中；F127/P105-MTX比PF-MTX具有更强的缓释作用,pH5.0条件下比pH7.4更有利于MTX的释放。PluronicP105/F127混合胶束具有良好的生物相容性和明显的MDR肿瘤的治疗作用,主要由网格蛋白和陷穴小泡介导的两种内吞途径入胞后,通过溶酶体转运,需要能量；对于耐长春新碱人口腔上皮癌细胞(KBv),F127/P105-MTX比PF-MTX显示出更强的药效。本文第二部分中,以KBv为MDR细胞模型,对F127/P105-MTX的作用机理进行研究,通过A-549和KBv细胞摄取与摄取抑制实验表明,F127/P105-MTX具有叶酸受体的亲和性,并且游离叶酸的存在对其摄取具有竞争性作用；体外3D肿瘤球实验显示F127/P105-MTX比PF-MTX具有更强的MDR实体肿瘤渗透能力和抑制肿瘤球生长的能力；大鼠体内药动学结果表明,F127/P105-MTX的AUC0→t是PF-MTX组的2.43倍；体内平均滞留时间(MRT)是PF-MTX组的1.34倍；清除率(CL)相对于PF组均显著降低,比物理载药胶束延长了药物的体内循环时间；小动物活体成像实验证明F127/P105-MTX明显增加了胶束在体内肿瘤部位的蓄积；药效学实验表明,F127/P105-MTX比PF-MTX显示出更显著的抑制MDR肿瘤的生长的作用,且安全性良好。进一步证实了键合方式载药胶束用于体内治疗耐药肿瘤具有可行性。本文第三部分中,选择了临床上常用于联合给药治疗乳腺癌的两种药物DOX与PTX为模型药物,将DOX键合于PluronicP105两端,并与F127包载PTX制备得到双载药混合胶束PF-DP。以载药量、包封率和细胞毒性为指标进行筛选,得到载体：DOX:PTX的最优比例为300mg:4mg:6mg;PF-DP总载药量为2.5%,粒径为25nm,具有缓释作用,pH5.0比中性条件下更有利于药物的释放。采用人乳腺癌细胞(MichiganCancerFoundation-7,MCF-7)及其耐药株(MCF-7/ADR)为细胞模型进行体外研究。细胞摄取和细胞器共定位结果表明,通过胶束联合给药显著增加耐药细胞内DOX和PTX的蓄积量,有利于发挥协同作用；这个过程需要能量,靠网格蛋白和陷穴小泡介导,受溶酶体酸性影响。细胞周期、细胞凋亡、细胞毒性和3D肿瘤球实验结果表明,DOX与PTX联合给药对于敏感和耐药肿瘤细胞都显示出协同作用,PF-DP对于耐药肿瘤细胞的毒性显著强于游离混合药物(DOX+PTX)。本文第四部分中,采用与肿瘤细胞和新生血管细胞高表达的整合素αvβ3特异性识别并结合的c(RGDyK)为靶向头基,表面修饰PF-DP,构建c(RGDyK)修饰的双载药混合胶束递药系统(c(RGDyK)-FP-DP)。理化性质表征显示,该靶向混合胶束与PF-DP相比,粒径、ξ电位、载药量和包封率以及体外的释放行为均没有发生显著变化。以整合素αvβ3受体蛋白高表达的人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)为新生血管模型,考察c(RGDyK)-FP-DP的体外抗血管生成作用。结果表明,靶向混合胶束显著增加HUVEC的摄取,这个过程是通过整合素受体介导的,需要能量,穿过HUVEC单层细胞后,可渗透入耐药肿瘤球较深部位；靶向混合胶束对HUVEC细胞毒性较低,具有抑制微管形成的作用。c(RGDyK)-FP-DP混合胶束对KBv耐药细胞显示出高的细胞毒性,增加了细胞摄取；在体内外显示出明显的KBv肿瘤靶向性。本文第五部分中,以荷KBv皮下瘤裸鼠为模型,对双载药混合胶束的组织分布和体内药效学进行考察。结果显示,混合胶束明显改变了药物在各主要组织器官的分布,减少了药物在心、肝和脾等正常组织的分布,增加了肿瘤部位的蓄积和血液中的循环时间。通过c(RGDyK)的修饰,进一步增加了肿瘤组织的药物量。药效学实验表明,c(RGDyK)-FP-DP具有明显抑制MDR肿瘤生长的作用,显著延长了荷瘤鼠的生存期,降低了药物的毒副作用,证实了c(RGDyK)-FP-DP在体内亦有的良好的肿瘤组织和新生血管的主动靶向性和有效治疗MDR肿瘤的双重效应。本研究可为耐药肿瘤的靶向治疗提供一定的参考和实验依据。
【作者】陈彦佐；
【导师】方晓玲；
【作者基本信息】复旦大学，药剂学，2013，博士
【关键词】多药耐药；药物-载体键合物；混合胶束；PluronicP105；PluronicF127；甲氨蝶呤；阿霉素；紫杉醇；联合给药；新生血管抑制；整合素受体；RGD肽；

【参考文献】
[1]刘敏.《考工记》车舆名物研究[D].苏州大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[2]李刘生.火电机组运行指标监管系统的研究与开发[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[3]傅俊旭.某型飞机发动机外涵道整流罩的国产化研制技术[J].航空工艺技术.1993(06)
[4]侯凌.西部山区高速公路重点路段设计安全性评价研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[5]赵艳博.乡村旅游开发研究[D].河北师范大学,人文地理学,2012,硕士.
[6]郑翔.基于BACnet与IPv6的智能楼宇组网设计与研究[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2014,硕士.
[7]李鹏.HL、CL型粳稻不育系的育性遗传及恢复基因定位[D].扬州大学,作物遗传育种,2011,硕士.
[8]郝新敏,张建春,杨元.医用多功能防护服研究与发展[J].中国安全科学学报.2005(06)
[9]何川.烟草连作对土壤有机碳含量、酶活性、碳源利用能力及微生物多样性的影响分析[D].河南农业大学,烟草学,2012,硕士.
[10]孙怡雯.国际投资仲裁中的东道国人权保护[D].厦门大学,国际法学,2014,硕士.
[11]潘雅玲.上市公司关联交易法律规制问题研究[D].北京交通大学,2014.
[12]王东.化玻企业决策支持系统研究[D].南京气象学院,2004.
[13]陆宁宁,谢敏,程世博,吕松伟,黄卫华.血液中循环肿瘤细胞捕获与释放方法研究进展[J].分析科学学报,2015,03:416-426.
[14]孙锴.我国人口政策的演变、问题与对策研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[15]张春华,王阳.数据挖掘技术、应用及发展趋势[J].现代情报,2003,04:47-48+50.
[16]范磊.转型变革情景下职业经理人胜任能力模型与开发策略研究[D].浙江大学,企业管理,2014,硕士.
[17]孙俊香.新课改背景下高中思想政治课情境教学探索与实践[D].山东师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[18]杨学瑜,顾合英.数据挖掘在选煤中的应用探讨[J].中国煤炭,2004,05:51+53.
[19]陈雪刚.基于灰色理论的农村物流与区域经济协调发展研究[D].北京交通大学,2012.
[20]陈婧.社会工作服务机构中社会工作者的激励机制研究[D].兰州大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[21]徐敏.七种枝角类分子系统分类的初步研究[D].淮北师范大学,植物学,2014,硕士.
[22]党晶.明代庄浪卫与鲁氏家族[D].青海师范大学,专门史,2012,硕士.
[23]刘爽.我国法律教育职业化导向研究[D].首都师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[24]付阳阳.“红色经典”的时代价值与传播策略研究[D].山东师范大学,传播学,2013,硕士.
[25]林祯秀.情绪的自主神经反应模式特异性研究[D].福建医科大学,精神病与精神卫生学,2014,硕士.
[26]李灿.境外人民币回流机制研究[D].吉林大学,世界经济,2014,硕士.
[27]易昌华,任文静,王钗.二次水声定位系统误差分析[J].石油地球物理勘探,2009,02:136-139+123+255.
[28]秦宇泰.Translation of Defamiliarization in Literary Works: a Case Study of Catch-22[D].西安外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[29]李阳.改性粉煤灰与微波协同作用下剩余污泥脱水性能与机制的研究[D].安徽建筑大学,市政工程,2013,硕士.
[30]叶高洁.含腙式结构的1，8-萘酰亚胺有机分子的光电性能研究[D].苏州大学,2012.
[31]万稳.大尺度激光跟踪测量关键技术研究[D].国防科学技术大学,机械工程,2012,硕士.
[32]崔建江,袁枫华,徐心和.冷连轧仿真系统过程优化计算机的设计与实现[J].控制与决策,2001,S1:725-728.
[33]李莹.妊娠中晚期糖尿病对胎儿发育影响的超声评价[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[34]孙毅.养老保险制度城乡一体化建设研究[D].云南财经大学,伦理学,2013,硕士.
[35]陈彩虹.生产性林木资产的特殊性及其会计核算研究[D].福建农林大学,林业经济管理,2010,硕士.
[36]周小圆.黄藤素树脂缓释微囊的制备、表征及释药特性研究[D].广东药学院,药剂学,2013,硕士.
[37]张晓飞.制造型企业系统化管理体系研究[D].天津财经学院,企业管理,2004,硕士.
[38]董醉心.我国生育保险制度的社会性别研究[D].南京师范大学,社会保障,2012,硕士.
[39]王爽.基于压缩感知的OFDM稀疏信道估计方法研究[D].江苏科技大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[40]张竹林.基于价值驱动型视角的中国邮储铜陵市分行营销策略研究[D].安徽大学,工商管理,2014,硕士.
[41]王建.论民事执行中的参与分配制度[D].安徽大学,法律,2012,硕士.
[42]■方丽朱赛鸿■FangLiZhuSaihong.光伏表皮材料与高层住宅立面一体化设计研究[J].城市建筑.
[43]陈翰.彩云阁：基于用户模型的服务组合平台[D].复旦大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[44]张钊谦,张贝克,夏涛,吴重光.一种新的计算机辅助故障树生成方法[J].计算机仿真,2005,10:132-136.
[45]张姝.侗族习惯法与我国刑法冲突问题研究[D].贵州民族大学,刑法学,2014,硕士.
[46]刘健.基于案例推理的知识系统的设计与实现[D].南京航空航天大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[47]张福铎.中国传统文化在美术教育中培养策略的研究[D].东北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[48]张松扬,严建文.非线性声波孔隙率模型及其应用[J].石油地球物理勘探,1998,05:671-678+690-706.
[49]赵国静.儿童文学翻译中的功能对等[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[50]王鑫.风电场并网对系统电压的影响分析[D].大连理工大学,电气工程（专业学位）,2012,硕士.