基于合理设计的聚合物纳米给药系统用于提高蛋白质多肽药物和siRNA体内外功效

【摘要】基于纳米载体的药物递送系统可提高药物稳定性、控释药物、促进药物体内吸收、改善治疗功效和降低毒副作用。为了充分发挥纳米载体的上述作用特点,必须全面系统研究其体内外作用机制,为合理设计纳米给药载体提供理论和实验依据。蛋白质多肽药物和基因等生物大分子因水溶性好、分子量大、体内生理环境影响其活性和稳定性等,透膜吸收较差,需借助载体递送方可更好发挥其功效。尤其是口服给药不借助载体递送根本无法有效使用,其中纳米载体是其主要的递送系统。纳米载体的理化性质如粒径、表面电荷等影响其细胞摄取、口服吸收和体内生物分布,研究其影响规律和机制,据此合理设计高效纳米递送系统。本文以壳聚糖衍生物聚合物纳米粒为模型,研究其粒径、表面电荷等理化性质对蛋白质多肽药物体内外吸收、分布的影响规律及机制。设计同时具有主动靶向作用、促进药物口服吸收和细胞摄取,并可有效克服小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)药物体内外递送屏障、介导高效体外基因沉默和口服后体内RNA干扰(RNAinterference,RNAi)功效的新型多功能壳聚糖衍生物-甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐(MTC)纳米粒,研究其作为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)siRNA口服给药递送载体的载药与释药、体内外作用机制、口服给药对脂多糖(LPS)/D-半乳糖胺(D-GalN)诱导小鼠或大鼠急性肝损伤及葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎的治疗功效。1聚合物纳米粒粒径与表面电荷对细胞摄取和生物分布的影响研究载蛋白质多肽药物聚合物纳米粒粒径、表面电荷对纳米粒细胞摄取及动物体内生物分布的影响和机制。可控制备粒径为150、500、1500nm和Zeta电势为-15、-25、-40mV的罗丹明B荧光标记羧甲基壳聚糖纳米粒RhB-CMCNP,包载FITC荧光标记的蛋白质多肽模型药物硫酸鱼精蛋白(FITC-PS),制得双荧光标记的载药聚合物纳米粒RhB-CMCNP-PS,研究表明血浆及I-环境中荧光稳定。研究了RhB-CMCNP-PS的细胞摄取,结果表明：荷较强负电且粒径较大的RhB-CMCNP-PS更易被小鼠腹腔巨噬细胞吞噬；荷较弱负电且粒径较小的RhB-CMCNP-PS更易被非巨噬细胞摄取,且纳米粒摄取行为呈细胞株依赖性；纳米粒在非巨噬细胞主要通过代谢能量依赖的、肌动蛋白介导的内吞入胞。H-22荷瘤昆明小鼠尾静脉注射RhB-CMCNP-PS后,荷较弱负电且粒径较小的纳米粒及所载药物更易在肿瘤部位蓄积。2聚合物纳米粒粒径对蛋白质药物口服吸收的影响研究载蛋白质多肽药物聚合物纳米粒粒径对药物释放、细胞摄取、小肠转运、口服吸收和动物体内生物分布的影响及机制。可控制备Zeta电势为-35mV、粒径分别为300、600、1000nm的罗丹明B荧光标记羧化壳聚糖纳米粒RhB-CCNP,包载FITC荧光标记的蛋白质多肽模型药物牛血清白蛋白(FITC-BSA),制得双荧光标记的载药聚合物纳米粒RhB-CCNP-BSA,研究表明血浆及含有各种类型化学荧光淬灭剂的溶液中荧光稳定。研究了粒径对RhB-CCNP-BSA的亲水性、Caco-2细胞摄取量、大鼠小肠黏膜黏附性、体外Caco-2细胞单层模型转运和吸收量、大鼠离体小肠转运和在体小肠吸收量的影响,结果表明均随粒径减小而增加。研究了RhB-CCNP-BSA的大鼠小肠在体释放,结果表明：粒径较小的RhB-CCNP可释放更多FITC-BSA至大鼠小肠黏膜而非肠腔中,避免FITC-BSA被肠腔内消化酶降解失活。小肠派氏结处M细胞是载药聚合物纳米粒转运和吸收的重要部位。健康昆明小鼠口服给药后,RhB-CCNP-BSA在血液和主要脏器的分布比例随粒径减小而增大；H-22荷瘤昆明小鼠口服给药后,粒径较小的RhB-CCNP-BSA经小肠转运吸收,可有效递送至血液和主要组织中。3基于MTC的siRNA口服高效纳米给药系统用于急性肝损伤的治疗及机制壳聚糖(Mw200kDa,500kDa)经季铵化、甘露糖和巯基基团修饰制得MTC聚合物-MTC200和MTC500,季铵化度均为30%,甘露糖修饰度分别为11%和15%,游离巯基含量分别为109.7±2.5和105.4±3.1[μmol/g,二硫键含量分别为180.5±0.8和197.3±0.6μmol/g;与TPP离子交联制备纳米粒,包载TNF-αsiRNA,粒径约150nm,Zeta电势约30mV；纳米粒在生理环境结构稳定,保护siRNA免受核酶降解。MTC纳米粒可改善siRNA口服后的小肠转运和吸收,经全身血液循环、淋巴循环和巨噬细胞等作用递送siRNA至全身主要组织。研究了MTC纳米粒的巨噬细胞摄取,结果表明：MTC纳米粒促进巨噬细胞对siRNA的摄取及胞质释放,细胞摄取机制主要涉及小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮,与网格蛋白介导的内吞无关,可避免被溶酶体捕获。研究了载siRNAMTC纳米粒的巨噬细胞基因沉默效果,结果表明：MTC纳米粒体外可高效介导Raw264.7细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞的RNAi效应。LPS/D-GalN诱导急性肝损伤C57BL/6小鼠口服载siRNAMTC纳米粒后,血清TNF-α、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量和组织巨噬细胞TNF-αmRNA表达均显著降低,肝脏切片观察表明小鼠肝脏损伤得到显著缓解,小鼠存活率显著提高。与腹腔注射给药相比,C57BL/6小鼠口服MTC纳米粒后可将siRNA高效递送至血液和全身主要组织,体内基因沉默效率亦显著提高。LPS/D-GalN诱导急性肝损伤SD大鼠口服载siRNAMTC纳米粒后,血清TNF-a和组织巨噬细胞TNF-amRNA表达均显著降低,肝脏切片观察表明大鼠肝脏损伤得到显著缓解。C57BL/6小鼠口服MTC200NPs毒性试验结果表明MTC200NPs安全性良好。4基于MTC的siRNA口服高效纳米给药系统用于溃疡性结肠炎的治疗及机制调节MTC200与TPP的质量比,离子交联法制备粒径分别为150、1000nm和Zeta电势为30mV的MTC200NPs和MTC200LNPs,包载TNF-αsiRNA。研究了MTC200NPs和MTC200LNPs的结构稳定性、siRNA体外释放、巨噬细胞摄取和基因沉默、Caco-2细胞单层转运,结果表明：二种纳米粒生理环境结构稳定,体外siRNA释放、Raw264.7细胞摄取和Raw264.7细胞体外基因沉默效率均无显著差异：但MTC200LNPs的Caco-2细胞单层转运和摄取量显著低于MTC200NPs。健康C57BL/6小鼠口服载siRNAMTC200LNPs后血液和主要组,织中siRNA的含量显著低于MTC200NPs;溃疡性结肠炎C57BL/6小鼠口服载siRNAMTC200LNPs后可避免被小肠正常上皮组织吸收而特异性聚集在炎症部位并促进巨噬细胞的摄取,故与MTC200NPs相比,MTC200LNPs在结肠局部炎症部位的siRNA分布百分比显著提高。研究了溃疡性结肠炎小鼠口服载siRNAMTC200LNPs和MTC200NPs的体内RNAi功效,结果表明：小鼠结肠组织TNF-α含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γmRNA的相对表达和MPO含量均显著降低,显著缓解小鼠体重下降和结肠组织局部炎症,MTC200LNPs的治疗效果优于MTC200NPs。C57BL/6小鼠口服MTC200NPs毒性试验表明MTC200LNPs安全性良好。5MTC纳米粒的siRNA结合-释放与体内外转染效率的关系选用三聚磷酸钠(TPP)、透明质酸(HA,Mw100kDa)和丙烯酸树脂III号(EudragitS100,ES)为离子交联剂,与MTC聚合物经离子交联法制备7种纳米粒,包载TNF-αsiRNA,通过改变离子交联剂种类和比例调节siRNA的释放速度；制得MTC纳米粒粒径为120-225nm、Zeta电势为18-37mV,多分散系数(P.I.)均小于0.3,粒径分布均匀：MTC纳米粒的包封率均高于98%。MTC纳米粒结构稳定,可有效保护siRNA在小鼠体液中免遭核酶降解。最低肝素钠解离浓度试验和体外释放试验结果表明,MTC纳米粒对siRNA的结合能力随离子交联剂种类的增多、离子交联剂中HA和ES比例的升高而增大,siRNA的释放速率和累积释放量与之相反。MTC纳米粒细胞黏附、细胞摄取量和细胞摄取速度均无显著性差异。研究了MTC纳米粒介导体外Raw264.7基因沉默效果,结果表明：缓慢释放siRNA的MTC纳米粒高效介导长时程基因沉默,可用于口服给药有效治疗C57BL/6小鼠慢性局部炎症-溃疡性结肠炎；快速释放siRNA的MTC纳米粒高效介导短时程基因沉默,可用于口服给药有效治疗C57BL/6小鼠急性全身性炎症-急性肝损伤；针对不同类型的炎症模型应选取具有不同siRNA结合-释放速率的MTC纳米粒。
【作者】何春柏；
【导师】印春华；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2012，博士
【关键词】聚合物纳米粒；蛋白质多肽药物；TNF-αsiRNA；siRNA口服纳米递送载体；粒径；表面电荷；纳米粒siRNA结合-释放速率；纳米粒稳定性；细胞摄取；口服吸收；生物分布；巨噬细胞基因沉默；主动靶向；羧甲基壳聚糖纳米粒；羧化壳聚糖纳米粒；甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐；急性肝损伤；溃疡性结肠炎；

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