苹果汁中脂环酸芽孢杆菌免疫磁性分离及快速检测技术研究

【摘要】脂环酸芽孢杆菌是苹果浓缩汁产业中关键的质量安全因子之一，对果汁的生产加工及出口贸易构成了严重威胁。研究建立高效、快速的检测方法，及时识别与发现苹果汁中脂环酸芽孢杆菌污染，切实保障苹果汁品质及质量安全，一直是工业化生产和科研工作者研究的热点。因此，本研究以脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体制备为基础，以免疫磁性纳米微球制备及免疫磁性分离体系构建为核心，以脂环酸芽孢杆菌免疫磁性分离及快速检测为目标，制备获得了基于大耳白兔的脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体；采用免疫学与材料学相结合的方法，构建了以免疫磁性微球为核心的脂环酸芽孢杆菌免疫磁性分离技术体系；通过免疫磁性分离方法与酶联免疫吸附测定法（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）及实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测技术结合，实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的快速检测及定量分析，构建了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌快速分离及检测技术体系，为苹果汁生产加工及国际贸易中脂环酸芽孢杆菌的快速识别提供了理论方法和技术支持。主要研究内容和结果如下：（1）以0.4%甲醛灭活的脂环酸芽孢杆菌标准菌株为免疫抗原，对新西兰大白兔进行免疫和血清分离，并以MabselectSure抗体纯化凝胶过滤柱为纯化体系，制备获得了脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，性能评价结果表明：两只新西兰大白兔免疫获得的多克隆抗体浓度分别为27.8mg/mL和20.8mg/mL；抗体的分子量为150kDa；间接ELISA检测结果表明抗体效价为40000。以12株脂环酸芽孢杆菌和51株非脂环酸芽孢杆菌为参比菌株评价多克隆抗体的特异性，结果表明：制备的多克隆抗体对脂环酸芽孢杆菌有非常好的识别特异性，间接ELISA方法与Westernblot体系检测结果高度一致。（2）以硅烷化改性和胺基化修饰为基本理论制备获得了性能良好的功能化磁性纳米微球，并通过多克隆抗体的固定化制备获得了免疫磁性微球。以免疫磁性微球中多克隆抗体的固定化量及其对脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性分离效果为评价指标，筛查获得了功能化磁性纳米微球与多克隆抗体最佳结合方式。研究结果表明：采用高碘酸钠对多克隆抗体分子中Fc区域糖链部分进行氧化处理，并以3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）胺基化改性的硅烷化磁性微球为固相材料，通过功能化磁性微球中胺基基团与抗体中醛基基团的定向反应制备获得的免疫磁性微球具有最高的生物活性和最佳的脂环酸芽孢杆菌分离效果。同时，通过分析与表征多克隆抗体功能结构及磁性纳米微球化学构成，解析了磁性纳米微球与多克隆抗体结合部位与作用位点，进一步揭示了脂环酸芽孢杆菌与免疫磁性微球特异性结合分子机制。（3）在明晰免疫磁性微球制备方法基础上，优化获得了功能化磁性微球对多克隆抗体固定化最佳条件，评价了免疫磁性微球吸附特异性，并构建了脂环酸芽孢杆菌免疫磁性分离体系。研究结果表明：磁性纳米微球对多克隆抗体的最大固定化量为75.6μg/mg，反应时间60min，且多克隆抗体的固定化过程符合Langmuir等温吸附模型和二级吸附动力学模型。以含有5%BSA和0.05%Tween-20的PBS缓冲液混合体系对免疫磁性微球封闭处理60min即可有效提高免疫捕获-分离体系的特异性。构建的免疫磁性分离技术体系中，免疫磁性微球用量2.5mg/mL，免疫捕获时间30min，在此条件下对菌体浓度104CFU/mL样品的分离率达到80%以上。平板计数法和ELISA检测结果表明：建立的免疫磁性分离体系对脂环酸芽孢杆菌具有非常好的特异性，可以实现目标微生物的高效分离与富集。（4）优化建立了基于间接ELISA方法的苹果汁中脂环酸芽孢杆菌检测技术：多克隆抗体浓度0.5μg/mL，酶标二抗的稀释倍数是2000倍；对间接ELISA体系非特异性吸附的封闭处理条件为0.5%BSA于37℃下封闭处理120min；抗原与抗体及抗体与酶标二抗反应温度37℃，反应时间60min，在此条件下，间接ELISA方法的检测灵敏度为105CFU/mL，检测时间6-7h。通过免疫磁性分离技术（IMS）与ELISA检测结合，构建了IMS-ELISA技术方法体系，实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的快速检测，其灵敏度为103CFU/mL，检测时间3h。免疫捕获-分离富集技术体系可以有效提高ELISA方法的检测灵敏度。（5）通过免疫磁性分离技术与PCR检测方法结合，构建了基于IMS-PCR方法的苹果汁中A.acidoterrestris快速分离与识别技术体系。研究结果表明，IMS-PCR方法的检测灵敏度为10CFU/mL，检测时间3-4h。对苹果汁样品检测结果表明：IMS-PCR方法的灵敏度、特异性及准确度分别为90.9%，97.0%和96.2%。因此，建立的IMS-PCR技术方法体系特异性强、灵敏度高、检测速度快，可以用于苹果汁中A.acidoterrestris的快速检测。IMS-PCR方法的构建为苹果汁中A.acidoterrestris的有效识别及高通量筛选提供了理论基础和技术保障。（6）以免疫磁性分离技术和Real-timePCR方法为核心，构建了基于IMS-Real-timePCR方法的苹果汁中A.acidoterrestris快速检测及定量分析体系，并以196份苹果及猕猴桃产品为供试样本，评价了方法的可靠性。研究结果表明：建立的IMS-Real-timePCR方法体系对A.acidoterrestris具有非常好的识别特异性，其检测灵敏度为3CFU/mL，检测时间2-3h。对无菌水、苹果汁和猕猴桃汁三种加标样本进行检测，IMS-Real-timePCR方法的扩增效率为108%-109%，标准曲线R2＞0.991。与平板计数法相比，IMS-Real-timePCR方法的检测灵敏度、特异性及准确度分别为90.0%、98.3%和97.5%。因此，构建的IMS-Real-timePCR方法体系可以实现苹果、猕猴桃及其制品中A.acidoterrestris的定量检测，并为果蔬加工体系中A.acidoterrestris的快速检测提供了新的思路和方法。
【作者】王周利；
【导师】岳田利；
【作者基本信息】西北农林科技大学，食品科学，2014，博士
【关键词】苹果汁；脂环酸芽孢杆菌；免疫磁性分离；富集；快速检测；

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