茶叶发酵过程中的多酚变化及其对黄曲霉产毒的抑制效应

【摘要】我国的茶叶在种植面积和产量均居世界第一位。近年来，由于环境污染和加工工艺不规范等导致的茶叶重金属污染、农残超标等问题使食品的安全保障面临严峻的考验。黄曲霉毒素是目前发现的毒性和致癌性最强的1A级危险物，目前研究表明茶叶也面临着该毒素污染的风险。然而目前人类尚不清楚影响茶叶遭受黄曲霉毒素污染的关键因素。在本项目中，我们采用价格低廉的原产信阳绿茶茶园的夏伏茶作为研究对象，接种普洱茶中分离出的菌种来生产微生物发酵茶，分析茶叶在自然发酵和人工接种微生物发酵过程中的多酚种类和含量变化的规律，研究茶叶水提物对黄曲霉生长和产毒的影响，筛选与茶叶黄曲霉毒素抑制相关的多酚组分，对其抑制黄曲霉产毒的分子机制进行了研究，并对茶多酚的神经保护功能进行了初步研究。1．针对目前存在的茶叶检测中的假阳性问题，本研究建立了一种以多克隆抗体为基础的一步间接竞争ELISA方法，该方法在PBS中的线性检测范围为0.14~126ng/mL，IC50和LOD检测值分别为3.85ng/mL和0.06ng/mL。该方法快速、简便、可用于大批量的检测，该方法与UPLC-MS/MS法检测的结果进行比较，准确度较高。用该方法检测了一批市售的常见茶叶，证实在茶叶中存在被黄曲霉毒素污染的风险。2．研究结果显示绿茶中的多酚物质主要是没食子酸、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯等。绿茶在微生物接种后,多酚的总量随发酵时间的延长而降低，其中接种黑曲霉、酵母菌及混合接种黑曲霉、酵母菌、根曲霉、青霉的茶叶中多酚含量下降趋势显著，分别从31.16%降到5.32%和7.35%。在微生物发酵初期，没食子酸、表没食子儿茶素、表儿茶素以及槲皮素和山奈酚的含量都有一定程度的增加，但是随着发酵的进行，各种儿茶素组分的含量均开始显著下降。表没食子儿茶素没食子酸酯在绿茶中的含量较高，达到26.59mg/g，随着发酵的进行其含量均迅速下降，发酵7d后，其含量在自然发酵中下降到5.97mg/g，人工发酵的其含量降低到0.27mg/g。在自然发酵和人工发酵过程中表儿茶素没食子酸酯的含量均下降。3．在绿茶样品中游离氨基酸的总含量为79.03mg/g，随着自然发酵和人工发酵的进行，其总含量均在发酵初期上升然后下降。在自然发酵过程中，发酵7d后其总含量最高，达到80.78mg/g。4．不同种类茶叶水提物对黄曲霉生长及其产毒作用研究结果显示，茶叶的水提物不能抑制黄曲霉的生长，但是在高浓度条件下，茶叶的水提物能够抑制黄曲霉毒素B1（AFB1）的产生并下调黄曲霉毒素产毒基因aflR和aflS的表达。茶多酚单体普遍有抑制黄曲霉毒素产生的活性，但是它们的浓度效应各不相同。槲皮素和没食子酸的抑制活性要高于同等浓度下儿茶素类茶多酚的抑制活性。而对于儿茶素类茶多酚，非酯型的抑毒活性要强于酯型儿茶素衍生物。茶多酚对黄曲霉生长的抑制活性较差，除了槲皮素外，其他茶多酚即使在最高试验浓度下也未发现抑制AFB1的生长。因此茶多酚对AFB1产生的抑制可能与其抗氧化活性有关。但是各种单体的抗氧化能力与其抑制毒素产生的能力并不一致。5．从黄曲霉菌的抗氧化系统、黄曲霉菌毒素产生的相关基因入手，通过研究槲皮素处理对它们的影响来揭示槲皮素抑制黄曲霉毒素产生的分子机制。研究结果证实槲皮素处理能够缓解黄曲霉菌的氧化胁迫状态。槲皮素通过激活抗氧化系统转录因子Yap1，导致黄曲霉体内的抗氧化酶活性增加，这种诱导机制很可能是槲皮素抑制AFB1产生的关键因素。槲皮素既能下调AflR的表达，又能下调AflS的表达。而AflS能够通过结合AflR调控产毒基因的表达，因此抑制AflR的作用很可能是槲皮素抑制AFB1产生的核心分子机制，这种机制也与其激活抗氧化系统缓解菌体内氧化胁迫的作用相对应。在AflR下调的情况下，产毒基因的表达会受到抑制。因此槲皮素作为一种高效的黄曲霉毒素合成抑制剂，具有较高的应用价值。6．蛛网膜下腔出血（SAH）引起的中风死亡率高达12%，线粒体机能障碍是蛛网膜下腔出血的早期特点，本论文探索了茶多酚的神经保护作用和在氧合血红蛋白引起SAH后，3h、6h、12h、24h乃至3d的小鼠大脑皮层线粒体膜电势、ATP含量和细胞色素c的变化。结果证明茶多酚能够通过阻滞线粒体膜电位的改变，增加ATP含量，减少细胞色素c的释放等途径发挥其神经保护功能。
【作者】张浩；
【导师】李华；
【作者基本信息】西北农林科技大学，食品科学与工程，2014，博士
【关键词】茶；发酵；多酚；黄曲霉；黄曲霉毒素；神经保护；

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