survivin在替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞凋亡及老化中的作用研究

【摘要】一、目的：细胞老化(CellularSenescence)是一种与衰老发生、肿瘤生成与进展、压力应激、损伤修复等多种人体生理病理过程广泛相关的细胞程序。近年来的研究表明,在肿瘤化学治疗中,肿瘤细胞常常维持正常的生理活动及代谢,停止分裂增殖,表现出细胞老化的表型以应对化学药物的作用。经过细胞毒药物处理的老化肿瘤细胞以长期的细胞分裂周期暂停,较低的增殖能力和侵袭能力为特征,可以被衰老相关的半乳糖苷酶染色所标记。尽管诱导细胞老化的药物作用机制各不相同,细胞老化广泛在各种不同细胞背景的药物治疗中都有所发现。替莫唑胺作为恶性胶质瘤一线化疗药物,也在近年来的研究中也显示了非常典型的细胞老化诱导作用。作为烷化剂类药物,替莫唑胺对DNA加甲基化产生包括O6-MeG等损伤位点,这些DNA损伤可以双向诱导凋亡或者是细胞老化。然而具体的介导细胞不同反应的内在机制却尚未明了。细胞老化与凋亡同样是替莫唑胺临床疗效在细胞水平上的具体表现。老化的胶质瘤细胞阻断了肿瘤的快速生长及侵袭和血管生成能力。特别考虑到替莫唑胺所能诱导的凋亡作用实际上相当有限,细胞老化对于替莫唑胺临床疗效的作用就更为重要了。但是,不同与凋亡彻底杀灭肿瘤细胞,老化的胶质瘤细胞仍然保持了一定的活力,同时细胞分裂增殖的停滞也阻断了替莫唑胺作为基因毒药物通过DNA的分裂复制扩大DNA损伤的作用。对于老化细胞长期命运的研究表明,细胞老化也并不是永久的细胞生长停滞,细胞有可能在一定的时间内通过老化逃脱(Senescenceescape)摆脱老化状态,重新增殖,从而使肿瘤复发。基于对细胞老化可逆性(Reversibilityofsenescence)的考量,如果能减少替莫唑胺诱导的细胞老化促使胶质瘤细胞凋亡,或者阻断老化细胞的逃脱,那么替莫唑胺的疗效将可能进一步提升。虽然有关细胞老化发生和维持的确切机制尚未能完全明了,既往的研究显示增殖和凋亡的相关细胞信号通路可能参与到细胞老化的调控中。这本质上也是协调各种细胞进程,避免相互矛盾的信号指令的需要。举例来说,当细胞决定进入老化状态的时候,凋亡和增殖的相关作用就会被抑制。Bcl-2作为抗凋亡基因就能够抑制细胞凋亡并且诱导细胞老化。本文着重对另一种抗凋亡蛋白,survivin的相关作用做进一步探讨。survivin是一种多功能的IAP家族蛋白,主要在胚胎及肿瘤组织中表达,介导细胞凋亡抵抗及细胞周期进程的推动。早期的研究表明survivin可以保护肿瘤细胞免受化疗药物诱导的凋亡作用及促进细胞增殖。基于以上证据,我们认为survivin有可能在胶质瘤替莫唑胺治疗中促进凋亡抵抗及老化细胞重新增殖。为此,本文采用干扰RNA抑制survivin在胶质瘤细胞中的表达并探索其在替莫唑胺诱导的细胞凋亡及老化中的效应。二、方法：1.细胞培养U251和U87细胞调合适浓度接种于6孔板或96孔板,加入含10%的胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃,CO2培养箱培养。细胞生长至良好状态和浓度用于后续实验。2.替莫唑胺干预细胞细胞生长至合适的浓度和状态,根据不同的实验目的和要求,用不同浓度的替莫唑胺干预U251、U87细胞24小时,进行相关检测,选取合适的剂量用于进行后续实验。3.MTT检测细胞活力按照1×104/孔的浓度将细胞接种于九十六孔板,按实验分组给予相应的处理因素,每组设6个复孔。处理终止后,用移液器吸去孔内培养基,每孔加入D-hanks溶液轻轻洗3次,每次洗3min,然后每孔加入MTT溶液(浓度为5g/L,现用现配)20gL,再每孔补加100μL无血清的DMEM培养液,于5%C0237℃培养箱中继续孵育。4h后,终止培养,慢慢吸去孔内培养基。然后每孔加入150μL的DMSO,室温震荡10min使蓝紫色结晶甲瓒充分溶解,在酶标仪490nm处测其OD值并计算各组细胞存活率。4.β-半乳糖苷酶染色观察细胞老化吸除6孔板中的细胞培养液,用PBS轻柔洗涤1次,加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液,室温下固定15分钟。吸除细胞固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次3分钟。吸除PBS,每孔加入1毫升染色工作液(见染色工作液的配制)。37℃孵育过夜,可以用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。注意37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。孵育完成后吸除工作液,加入2毫升PBS,普通光学显微镜下观察计数。染色工作液的配制：p-半乳糖苷酶染色液A10μl±p-半乳糖苷酶染色液B10μl-半乳糖苷酶染色液C930μl+X-Gal溶液50μl,使用聚丙烯(polypropylene)容器,不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制。5.流式细胞仪检测细胞调整合适2×105/孔的浓度接种至六孔板,按实验分组进行相应处理后,用PBS洗涤细胞一次后离心(2000rpm,5min)收集并使用用体积分数为70%的乙醇固定单细胞悬液,4℃保存备用。染色前用PBS洗去固定液；加100pLRNaseA37℃水浴30min避免RNA干扰；每份样本中加入400μLPI染色混匀,4℃避光30min后上机检测,记录激发波长为488nm处红色荧光。在细胞分选实验中,活细胞按说明书使用Ruby染色(Invitrogen)上机检测DNA含量,达到预设DNA含量标准的细胞被筛选后离心收集(2000rpm,5min),并接种全血清培养皿进一步进行集落生成实验。细胞调整至合适2×105/孔的浓度接种至六孔板,按实验分组进行相应处理后,细胞用不含EDTA的胰酶短暂消化后收集,然后用PBS洗涤重悬细胞2次(2000rpm离心5min)；加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞,再加入5μLAnnexinV-FITC于细胞悬液中,用移液器轻轻混匀,最后加入5μLPropidiumIodide;将样本处于室温、避光处反应5～15min,再进行流式细胞仪进行检测(激发波长488nm,发射波长530nm)。PI红色荧光通过PI通道；AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测。使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照,进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。分别计算凋亡细胞及坏死细胞占总细胞的比率,每组实验样本重复三次以上。7.Westernblot检测细胞蛋白表达细胞按实验分组处理完成后,以Western及IP细胞裂解液提取肿瘤细胞蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行蛋白印迹实验。以Actin为内参,将处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上,封闭后,孵育一抗和二抗,ECL显色,KODAKImageStation2000MM成像系统采集图像,获得图像用图像处理软件ImageTool3.0测定并分析条带灰度值以检测目的蛋白的表达水平。8.SiRNA干扰调合适的细胞浓度分别接种于六孔板或二十四孔板中,取状态良好的细胞进行实验。siRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司设计提供,打开离心管前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解,使用150ul附送的DEPC水重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。使用GIBCO提供的lip2000转染试剂进行转染。转染前一天,在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞,转染时细胞的汇合度要达到30-50%。将寡聚物-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。37℃,C02培养箱孵育24-96小时,直到适合进行基因阻断分析。9.细胞集落生成实验对指数生长期细胞,采用常规消化传代方法,制成细胞悬液。细胞悬液反复吹打,使细胞充分分散,单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数,并用培养基调节细胞浓度,待用。根据细胞增殖能力,将细胞悬液倍比稀释。一般按照10%的培养密度接种5ml细胞悬液到培养皿(直径60mm)中,以十字方向轻轻晃动培养皿,使细胞分散均匀。培养皿置37℃、5%C02中培养2-3周,中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。当培养皿中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS液小心浸洗2次,空气干燥。甲醇固定15分钟,弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟,流水缓慢洗去染液,空气干燥。10.统计学分析实验结果用SPSS13.0统计软件分析。本实验数据属于完全随机设计的计量资料,故采用单因素方差分析one—wayANOVA进行方差分析,方差齐时采用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时采用Dunnett’sT3法进行组间多重比较,实验数据以x±s表示。P<0.05为有显著性差异。三、结果：1.survivin干扰增加U251胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性替莫唑胺具有双向诱导细胞凋亡及细胞老化的作用,在100μM左右的临床相关剂量单次处理U251胶质瘤细胞可以在一周内观察到明显的细胞凋亡及老化的反应。为了研究survivin在替莫唑胺诱导的细胞老化及凋亡中的作用,我们采用小干扰RNA对U251细胞中的survivin进行干扰,以随机对照序列作为参照。由免疫印迹法检测U251中的survivin的表达,替莫唑胺处理后的U251细胞中的survivin处于稳定表达的状态,经干扰survivin的SiRNA处理的实验组细胞survivin表达被明显抑制,而对照组无变化。实验组细胞和对照经过替莫唑胺处理后的生长曲线表明survivin干扰增加U251胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性,实验组细胞相较对照早期出现明显的细胞数目下降,并在一周左右的时间内出现细胞生长停滞,将细胞数目稳定在一个相对较低的水平内。进一步的流式细胞分析凋亡细胞比例及周期分布显示实验组早期细胞数目的下降是由于凋亡细胞比例的增加,而细胞生长停滞的原因则是因为之后出现G2/M分裂间期细胞数目和半乳糖苷酶染色阳性的老化细胞数目的上升。以上结果提示,survivin促进了胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗抵抗,沉默survivin的表达使U251对替莫唑胺的反应由细胞老化转向凋亡。2.替莫唑胺诱导的老化U251细胞长期培养后的再增殖和老化逃脱细胞老化以往被定义为一种不可逆的细胞进程,即细胞无法再获得增殖能力。近年来的研究表明,对于失去自我增殖调控、快速增殖的肿瘤细胞,可以在老化后长时间培养中再次获得自我更新(self-renewal)的能力。为此,我们使用Ruby染色流式分选TMZ处理后的老化细胞,并从这些老化细胞的长期培养中建立了两个可以稳定增殖的老化逃脱(senescenceescape)细胞亚克隆,SE3-U251及SE5-U251,用以研究胶质瘤细胞老化逃脱的现象。使用免疫印迹法检测SE3-U251及SE5-U251的蛋白表达发现明显的survivin表达上升,相较其老化的父辈细胞,这两只老化逃脱的细胞对替莫唑胺的治疗也显得更为抵抗,流式细胞检测凋亡比例发现替莫唑胺诱导的凋亡在SE3-U251及SE5-U251细胞明显下降。本章研究说明替莫唑胺诱导的老化胶质瘤细胞可通过长期培养自行获得再次增殖的能力,其衍生的老化逃亡高表达survivin并开始对替莫唑胺诱导的凋亡抵抗,提示survivin在细胞老化逃脱过程中有重要作用。3.Survivin促进U251细胞老化逃脱。为了进一步阐述survivin在U251细胞老化逃脱的作用,我们将针对survivin的小干扰RNA转染至替莫唑胺诱导的已经老化的U251细胞之中,并集落生成实验分别检测细胞凋亡及增殖潜力。结果显示：但显著抑制了细胞集落的生成,周期检测进一步说明survivin的表达能够使部分细胞恢复S期的分布。以上实验说明了survivin在胶质瘤细胞老化逃脱的促进作用。4.抑制U87细胞的survivin表达促进替莫唑胺诱导的p53依赖的凋亡发生。p53是介导细胞内外界压力反应的重要抑癌蛋白,能够阻断细胞周期进程及诱导凋亡。在发病年龄较大的胶质瘤患者及原发性胶质瘤病例中,有很大一部分肿瘤组织表达完整的野生型p53。大体上p53承担与survivin大致相反的细胞功能。之前的研究还显示,激活p53能够直接结合survivin启动子对其进行负向调节。这说明肿瘤细胞的p53蛋白表型有可能决定自身survivin能否表达以致发挥作用,也将影响survivin靶向干预的效果。为了能进一步揭示survivin与p53潜在相互作用,以及两者与替莫唑胺诱导的凋亡间的关系。我们选择表达野生型p53的U87细胞进行后续研究。免疫印迹法检测U87蛋白表达显示替莫唑胺能够充分诱导p53蛋白表达与激活(p21蛋白的转录激活),但使用干扰RNA抑制U87细胞的p53及survivin表达显示两者间并无直接的调控关系。与上文结果一致,抑制survivin表达增加U87对替莫唑胺的敏感性及凋亡反应,而混合转染p53及survivin干扰RNA的细胞则能部分免于替莫唑胺的凋亡诱导。综合上述结果说明,抑制survivin导致的凋亡增加依赖于p53的表达,显示在U87细胞中,survivin可以拮抗由替莫唑胺激活的p53诱导凋亡的作用。四、结论：1.细胞老化而非凋亡是替莫唑胺作用胶质瘤细胞最主要的反应。2.survivin干扰增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性,主要表现为早期发生凋亡反应及老化细胞的生成减少。3.老化胶质瘤细胞长期培养后可以逃脱增殖停滞并重新扩增,老化逃脱的细胞对替莫唑胺诱导的凋亡进一步抵抗。4.Survivin促进U251细胞老化逃脱。5.抑制U87细胞的survivin表达促进替莫唑胺诱导的p53依赖的凋亡发生
【作者】宋振华；
【导师】柯以铨；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】替莫唑胺；胶质瘤；细胞老化；凋亡；survin；p53；

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