AY9944 A-7对绵羊卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎早期发育能力的影响

【摘要】在胆固醇生物合成途径中存在两种与卵母细胞减数分裂密切相关的中间产物,即卵泡液促减数分裂甾醇(folliclefluidmeiosis-activatingsterols,FF-MAS)和睾丸促减数分裂甾醇(testismeiosis-activatingsterols,T-MAS)。FF-MAS在△14-还原酶的作用下进一步转化为T-MAS。AY9944A-7是△14-还原酶的抑制剂,AY9944A-7通过抑制FF-MAS向T-MAS转化,阻止FF-MAS向下游代谢,从而促进FF-MAS在卵巢中的累积。目前在小鼠、大鼠及猪上已有关于AY9944A-7促卵母细胞减数分裂的报道。本试验首次以绵羊为研究对象,较系统地探究AY9944A-7在绵羊卵母细胞抑制剂阻滞的体外成熟、自发体外成熟以及促性腺激素诱导的体外成熟中的作用；以体外成熟过程中皮质颗粒的时空迁移作为绵羊卵母细胞胞质成熟评定的指标,探讨AY9944A-7对体外培养卵母细胞胞质成熟的影响；以胚胎卵裂率、囊胚率及囊胚／2-细胞胚比率反映卵母细胞成熟的质量以及胚胎发育能力,研究AY9944A-7成熟处理的卵母细胞孤雌胚早期发育能力。研究结果如下：以Hx(4mM)和IBMX(250μM)为抑制剂,用不同剂量的AY9944A-7(0,10,20,30,40μM)处理体外培养的绵羊卵丘-卵母细胞复合体(COCs)、分离的卵丘、卵母细胞(splitCOCs)和COCs脱卵丘后制成的裸卵(denudedoocytes,DOs),研究AY9944A-7对Hx或IBMX阻滞的的绵羊卵母细胞恢复减数分裂的作用。结果表明,AY9944A-7能够诱导Hx和IBMX抑制的绵羊COCs恢复减数分裂成熟,但是将卵丘细胞和卵母细胞分离后共培养,AY9944A-7对其减数分裂恢复有一定的刺激作用,但不足以刺激其完成减数分裂达到核成熟,AY9944A-7不能诱导绵羊DOs克服抑制作用恢复减数分裂；AY9944A-7诱导绵羊卵母细胞克服抑制恢复减数分裂成熟的适宜剂量为20～30μM。40μMAY9944A-7处理的卵母细胞退化率显著增加(P<0.01)。将绵羊卵母细胞从卵泡抑制环境释放出来,培养于体外自发成熟培养模型24h后,82.25%的卵母细胞恢复减数分裂(GVBD%),72.46%的卵母细胞排出第一极体(PBI%)。添加10,20,30μM的AY9944A-7,绵羊COCsGVBD发生率分别达到88.67%,91.29%,89.33%,PBI排出率分别达到85.94%,88.44%,85.27%,均显著高于不添加AY9944A-7的对照组(P<0.05,P<0.01).AY9944A-7对于splitCOCs以及DOs无显著作用,AY9944A-7促进绵羊卵母细胞体外自发成熟的适宜剂量是20μM,30-40μMAY9944A-7对卵母细胞有毒性,导致退化死亡率升高。以Hx(4mM)或IBMX(250μMM)抑制绵羊COCs自发成熟,通过添加FSH(10μg/ml)或LH(10μg/ml)诱导其恢复减数分裂,探究AY9944A-7(20μM)在FSH或者LH诱导的体外培养的绵羊COCs减数分裂恢复过程中的可能作用。FSH能克服HX或IBMX的抑制,诱导绵羊COCsGVBD发生,排出第一极体(P<0.01),LH不能诱导绵羊COCs恢复减数分裂成熟；不论在哪一种抑制剂作用下,添加AY9944A-7对于FSH诱导的绵羊COCsGVBD发生率和PBI排出率都有显著的促进作用(P<0.05或P<0.01)。以体外成熟过程中皮质颗粒的时空迁移作为绵羊卵母细胞胞质成熟评定的指标,探讨不同浓度AY9944A-7(0,10,20,30,40μM)对体外培养绵羊卵母细胞胞质成熟的影响。结果表明,10,20μMAY9944A-7组皮质颗粒正常迁移分布率分别为72.29%和78.81%,较对照组分别提高了10.02%和16.54%,说明适宜浓度的AY9944A-7对皮质颗粒的正常迁移和组装有一定的促进作用,对于改善卵母细胞胞质成熟有积极的作用。挑选经不同剂量的AY9944A-7(0,10,20,30,40μM)培养成熟的排出第一极体的绵羊COCs,选择卵周隙明显、卵细胞膜完整的进行孤雌激活,孤雌胚胎进行体外培养,统计卵裂率、囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率,研究AY9944A-7对绵羊体外成熟卵母细胞孤雌胚胎发育能力的影响。结果表明,添加不同浓度的AY9944A-7处理的卵母细胞成熟后进行孤雌激活,孤雌胚的卵裂率均较未经AY9944A-7刺激成熟的卵母细胞高,但只有20μMAY9944A-7处理的卵母细胞与对照组存在显著差异(P<0.05)。10和20μMAY9944A-7处理的卵母细胞囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(17.17%和22.73%vs.13.24%,P<0.05；24.07%和29.53%vs.15.42%,P<0.05),表明10～20μMAY9944A-7即可提高卵母细胞胞质成熟的质量,使胚胎的发育能力提高。综上所述,体外成熟培养液中添加20μMAY9944A-7提高了绵羊卵母细胞体外成熟率,改善了成熟质量,提高了胚胎早期发育能力。
【作者】郝瑞荣；
【导师】岳文斌；
【作者基本信息】山西农业大学，动物遗传育种与繁殖，2013，博士
【关键词】AY9944A-7；绵羊卵母细胞；减数分裂；皮质颗粒；胚胎发育能力；

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