细胞毒性脑水肿的发生发展过程中AQP4内化和溶酶体分选现象及其机制的研究

【摘要】背景脑水肿不仅可以导致脑细胞功能障碍，而且可造成颅内高压，影响脑的血液灌流，甚至形成脑疝而致病人死亡。脑水肿的发生与脑内水转运异常有关。水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）是一种水转运蛋白，它在脑内呈极性分布于胶质细胞膜上，包括星形胶质细胞在微血管周围形成的细胞足突，软脑膜内表面形成的胶质界膜和室管膜细胞的基底膜等部位。这些部位都是脑实质与脑血管或脑脊液相交界的部位，提示AQP4的这种极性分布形式在脑实质与脑血管/脑脊液的水转运过程中发挥重要作用。脑水肿主要有细胞毒性和血管源性两种类型，细胞毒性脑水肿的形态学特点主要表现为水分在细胞内滞留，细胞肿胀，但血脑屏障保持完整；而血管源性脑水肿则表现为水分在细胞间聚集，细胞间隙增大，血脑屏障破坏。AQP4在不同类型脑水肿中的作用不同。AQP4表达增加可促进经AQP4转运进入细胞内的水分，从而加重细胞毒性水肿；而AQP4表达增加却有利于细胞间隙多余水分的清除，从而减轻血管源性水肿。因此，对于不同类型的脑水肿，针对AQP4有不同的治疗策略：抑制AQP4的水转运功能有利于减轻细胞毒性水肿；而促进AQP4的水转运功能有利于减轻血管源性脑水肿。在脑缺血、癫痫和颅内肿瘤等多种疾病造成脑水肿的动物和患者脑内，AQP4的蛋白表达水平和极性分布形式发生改变，但是其机制仍不明确。有资料显示，包括AQP4在内的部分膜蛋白可以从细胞膜内化（internalization）至细胞内，同时伴随其水转运功能的改变。内化进入细胞内的膜蛋白可被分选（sorting）至溶酶体，被水解酶降解。脑内疾病所致的AQP4极性分布的改变是否与其内化和分选过程有关，目前未见报道。如果证实在脑水肿的发生过程中存在AQP4内化和溶酶体分选的现象，将为针对AQP4对脑水肿进行治疗的策略提供新思路。促进AQP4的内化和溶酶体降解，以减少在细胞膜上发挥水转运功能的AQP4，进而减少通过AQP4进入细胞内的水分，将有利于减轻细胞毒性脑水肿；而抑制AQP4的内化和溶酶体降解将使AQP4仍呈极性分布于胶质细胞膜上，有利于促进细胞间隙中多余水分的清除以减轻血管源性脑水肿。目的在大鼠脑缺血和细菌性脑膜炎这两种模型中，研究在脑水肿的发生发展过程中，是否存在AQP4内化和溶酶体分选的现象并对其机制进行初步探讨。内容和方法本研究包括两部分：第一部分，研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选，并对其机制进行初步探讨；第二部分，研究在大鼠脑膜炎脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选。第一部分⑴研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选：用线栓法制作大脑中动脉栓塞（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）的大鼠脑缺血模型；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl-tetrazoliumchloride,TTC）染色方法观察脑内缺血的部位和程度；采用透射电镜观察脑缺血早期脑内的超微结构，以明确脑水肿的类型；运用免疫荧光双标的方法检测AQP4分别与早期内涵体标记物（earlyendosomeantigen-1,EEA1）和溶酶体标记物（lysosomalassociatedmembraneprotein-1,LAMP1）的共定位，运用图像分析软件Image-ProPlus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。⑵初步探讨AQP4内化和溶酶体分选的机制：在脑缺血模型中，经颈外静脉注射蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）激动剂佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate,PMA），采用干湿重法、透射电镜观察及WesternBlot分别检测脑含水量，星形胶质细胞水肿程度和AQP4蛋白的表达；采用免疫荧光双标检测AQP4分别与EEA1及LAMP1的共定位，运用图像分析软件Image-ProPlus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选：经幼鼠延髓小脑池注入B族溶血性链球菌（groupBhemolyticStreptococcus,GBS）建立细菌性脑膜炎模型；采用干湿重法、伊文思蓝（EvansBlue,EB）含量测定法、透射电镜观察、WesternBlot等分别检测脑膜炎幼年大鼠脑含水量、血脑屏障通透性以及AQP4，α-dystroglycan（α-DG）和β-dystroglycan（β-DG）的表达水平；采用免疫荧光双标检测AQP4分别与早期内涵体标记物EEA1,晚期内涵体标记物甘露糖-6-磷酸受体（mannose-6-phosphatereceptor,MPR）及溶酶体标记物LAMP1的共表达，运用图像分析软件Image-ProPlus6.0测量AQP4与EEA1/MPR/LAMP1共表达的比例。结果第一部分⑴大鼠缺血性脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选：①TTC染色：正常对照组和缺血1h组未见缺血灶；缺血3h,6h,12h,24h组可见缺血灶；②电镜观察：缺血3h时，血管周围胶质细胞肿胀，血管内皮细胞紧密连接未被破坏，血管基底膜完整；③缺血后各组（1h,3h,6h,12h,24h时间点）AQP4与EEA1共表达，共表达比例较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；④缺血后各时间点（3h,6h,12h,24h）AQP4与LAMP1共表达，共表达比例较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。⑵AQP4内化和溶酶体分选机制的研究：①PMA处理后，脑含水量在缺血后1h,3h下降（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；缺血6h及以后各时段，PMA对脑含水量无显著影响（与溶剂对照组比较，P＞0.05）；②电镜观察：PMA处理后，缺血后（3h）血管周围胶质细胞水肿程度减轻（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；③PMA处理后，缺血后（3h）AQP4表达水平下降（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；④PMA处理后，缺血性脑水肿模型中，AQP4分别与EEA1及LAMP1共表达的比例较溶剂对照组无差异（P＞0.05）。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选：①模型组脑含水量较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；②模型组EB含量与对照组无统计学差异（P＞0.05）；③电镜观察：血管周围胶质细胞肿胀，血管内皮细胞紧密连接未被破坏，血管基底膜完整；④模型组AQP4表达水平较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑤模型组α-DG和β-DG蛋白表达水平较均对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑥模型组中，AQP4分别与EEA1、MPR及LAMP1共表达，共表达比例较对照组增加（P＜0.05）。结论1.大鼠缺血性脑水肿模型中，存在AQP4内化和溶酶体分选现象。2.PKC激动剂PMA可下调AQP4的表达并减轻缺血早期细胞毒性脑水肿，但PMA对AQP4表达的下调作用不是通过促进AQP4内化和溶酶体分选实现的。3.大鼠脑膜炎脑水肿模型中，AQP4表达上调，同时存在AQP4内化和溶酶体分选现象。
【作者】黄娟；
【导师】孙善全；
【作者基本信息】重庆医科大学，组织工程与细胞工程，2014，博士
【关键词】水通道蛋白-4；脑水肿；脑缺血；脑膜炎；内化；

【参考文献】
[1]李建中,刘显敏.大数据的一个重要方面:数据可用性[J].计算机研究与发展,2013,06:1147-1162.
[2]夏海蛟,汪剑.基于Client/Server技术的成本管理系统的开发与实现[J].冶金自动化,2013,06:29-33.
[3]石冠鑫.CFRP层合板紫外线辐照后性能演变与抗冲击性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料科学,2013,硕士.
[4]何洋.花椒挥发油改善心得安所致豚鼠耳部银屑病样局部皮肤病变的药理作用研究[D].南方医科大学,药理学,2012,硕士.
[5]王筠菲.气候变化对水稻生产和效率的影响评价[D].南京农业大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[6]张梦.同位素示踪法研究植物细胞壁木聚糖与木素的化学键连接[D].湖北工业大学,制浆造纸工程,2013,硕士.
[7]雷威,丁沭沂,张晓兵,王保平.基于碳纳米管冷阴极的全封装X射线管[A].中国电子学会真空电子学分会、大功率微波电真空器件技术国家级重点实验室.中国电子学会真空电子学分会第十九届学术年会论文集（下册）[C].中国电子学会真空电子学分会、大功率微波电真空器件技术国家级重点实验室:,2013:5.
[8]黄伟.新加坡人民行动党政治精英录用模式研究[D].华中师范大学,国家治理与考选制度,2013,硕士.
[9]陈晓琳.伯顿·华兹生译中国古诗词翻译风格研究[D].河北师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[10]罗云瀚,王芳,葛菁华,陈哲,唐洁媛,余健辉,卢惠辉,张军,林宏奂,隋展.基于洛匈棱镜的偏振度测量与空间退偏度分析方法研究[J].光子学报,2014,09:141-145.
[11]庞洪泉.甜菜NBS-LRR类抗性基因序列分析及其转基因体系研究[D].浙江大学,作物遗传育种,2004,硕士.
[12]雷庆,吴扬扬.识别和抽取XML文档中的关系信息及其出现模式[J].清华大学学报(自然科学版),2005,S1:1757-1761.
[13]郑利宏.浩尧尔忽洞金矿矿床地球化学特征及矿床成因[D].长安大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[14]袁黎.夏热地区建筑双层隔热表皮隔热性能研究[D].华中科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[15]刘磊.分布式光纤拉曼温度传感系统及其应用研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[16]巴富.基于Web的智能在线求职系统[D].华中科技大学,2004.
[17]王芳.几类非线性泛函微分方程的振动性研究[D].中北大学,应用数学,2014,硕士.
[18]冯伟.实时视频增强与目标定位技术的研究与实现[D].北京交通大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[19]张苏楠.莎剧《奥瑟罗》的法律之维[D].山东大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[20]张翠.维吾尔族金店名称的调查与分析[D].新疆师范大学,中国少数民族语言文学,2014,硕士.
[21]赵志田.城市老工业区改造项目可行性研究[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[22]段丽莎.小学数学教材“解决问题”集中编排的比较研究[D].杭州师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[23]封晶晶.金庸武侠剧的喜剧性效果生成机制研究[D].河北师范大学,艺术学,2012,硕士.
[24]刘子男.“亲亲相隐”纳入我国刑法规范研究[D].西南大学,民商法学,2014,硕士.
[25]卢虎.人体呼吸道有限元模型及其对气道局部收缩时气体流动的数值模拟计算[D].重庆大学,生物医学工程,2013,硕士.
[26]佘春东.数据挖掘算法分析及其并行模式研究[D].电子科技大学,2004.
[27]亓立敏.基于声强法的高速列车车内噪声源识别技术研究[D].西南交通大学,车辆工程,2014,硕士.
[28]王双成,王辉,许广林.具有传递变量的动态贝叶斯网络结构学习[J].控制与决策,2010,11:1737-1741+1746.
[29]王琦.玉米ZmCIPK8基因在逆境胁迫下的功能分析[D].河南农业大学,植物学,2012,硕士.
[30]刘春慧.A集团财务管控优化方案设计[D].北京交通大学,2014.
[31]杨鹏.负性协同刺激分子B7-H1在人结直肠癌表达的调控机制[D].苏州大学,免疫学,2012,硕士.
[32]郑龙阔.旺隆热电厂湿法烟气脱硫技改研究[D].华南理工大学,动力工程,2012,硕士.
[33]庞可昌.小夹板治疗桡骨远端骨折布带约束力及纸压垫厚度的生物力学研究[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[34]马超.具有充气功能的全自动中空玻璃合片机混充气技术及仿真[D].北方工业大学,机械工程,2013,硕士.
[35]袁鹏.太赫兹波光子晶体光纤的传输特性研究[D].兰州理工大学,物理电子学,2014,硕士.
[36]陈裕国.非诉行政执行研究[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[37]章晓富.左乙拉西坦单药治疗新诊断癫痫患者的临床疗效及对骨密度和骨代谢的影响[D].郑州大学,神经病学,2013,硕士.
[38]田作辉.非事实类问题的答案选取[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[39]金光昊.吉林邮政企业财务分析及对策[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[40]郭美玲.寻找“说得着”的人[D].西南大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[41]王孝荣.猕猴桃白酒酿造技术研究[D].西南大学,农产品加工及贮藏工程,2014,硕士.
[42]贾会宾.记忆的谷歌效应：认知与神经机制[D].华中师范大学,基础心理学,2014,硕士.
[43]戴立民.基于遗传算法的装配顺序规划研究[D].河北工业大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[44]邢馨月.婉约沉郁 缠绵忠爱[D].长春师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[45]吴锐.山西隰县千佛庵大雄宝殿建筑、彩塑创建年代新探[J].文物.1998(05)
[46]李洁,崔锦瑞.500kV变电站报警信息和事故处理流程优化[J].电力系统自动化,2009,02:101-103.
[47]吴鹏飞.基于FPGA的LFMCW太赫兹成像系统的建模与仿真[D].河北大学,电路与系统,2014,硕士.
[48]张新芝.乌鲁木齐铁路中学校本师资培训可行性研究[D].西北师范大学,2002.
[49]李昕.文学翻译中陌生化手法的再现[D].湖南师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[50]陈栋芬.垫板及环口板加强型方钢管节点静力性能研究[D].华侨大学,结构工程,2014,硕士.