茶树多酚氧化酶的提取、分离纯化及其部分酶性质研究

【摘要】多酚氧化酶(PolyphenolOxidase,PPO)对茶树的生理代谢和生产加工都有着极为重要的作用,然而目前缺少对茶树PPO单一同工酶的研究。本课题以绿茶适制性最好的龙井43号茶树品种为材料,通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析,分离纯化得到三种PPO单一同工酶,并对PPOⅠ、PPOⅢ的酶学特性进行了研究。主要研究结果如下：(1)以龙井43号茶鲜叶为材料,在不同的单因素条件下提取粗酶液,通过测定粗酶活性和非变性凝胶电泳比较同工酶条带等,确定PPO粗酶提取的最佳条件。结果表明,以料液比1：2,加入内含5%PVP(w/v)经预冷的pH7.2柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.15mol/L),冰浴研磨,隔夜浸提12h,于4℃、9000r/min离心35min,取上清液,过滤制得的PPO粗酶液活性最高,出现5条明显的同工酶带。(2)最佳提取条件得到的PPO粗酶,经优化确定以30%-80%的硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白,沉淀经超滤脱盐浓缩,再经过DEAESepharoseCL-6B阴离子交换层析、SephndexG-150凝胶过滤层析纯化得到三条电泳纯的PPO单一同工酶(PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ、PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ的大小分别为38kDa、48kDa和80kDa,分别被纯化14.41、1.08和1.30倍,比活力为7177.0U/mg、537.45U/mg和648.22U/mg。(3)酶学特性研究表明,PPOⅠ的最适pH为5.6,PPOIII的最适pH为6.8,二者在pH5.6-7.2的范围内均能保持60%以上的相对酶活。PPOⅠ、PPOⅢ的最适温度分别为30℃和35℃,25℃-40℃的温度范围内,二者活性均较高；温度超过60℃时,二者基本失活。亚硫酸钠、半胱氨酸、抗坏血酸均对PPOⅠ、PPOⅢ有抑制作用,半胱氨酸抑制效果相对较好,低浓度的Cu2+对PPOⅠ、PPOⅢ的活性有促进作用。以邻苯二酚为底物时,PPOⅢ对底物的亲和力要强于PPOⅠ。PPOⅠ的Km值为91.34mmol/L,PPOⅢ的Km值为51.65mmol/L。
【作者】许雷；
【导师】黄友谊；
【作者基本信息】华中农业大学，茶学，2014，硕士
【关键词】茶树龙井43号；多酚氧化酶；分离纯化；同工酶；酶学特性；

【参考文献】
[1]邓自旺,钱君龙,屠其璞,濮培民,黄纯朴,柯善哲,黄耀生,唐劲松,柯晓康.环境因素对天目山柳杉树轮δ~(13)C方位分布的影响[J].植物生态学报,2003,01:93-98.
[2]岳宁.失肌皮神经损伤胸大肌部分移位重建屈肘术后供受肌内MuRF1和MAFbx的表达变化[D].遵义医学院,人体解剖与组织胚胎学,2013,硕士.
[3]张凯慧.M公司薪酬管理体系设计研究[D].陕西科技大学,企业管理,2013,硕士.
[4]吴继红.慢性高眼压视网膜神经节细胞进行性死亡的线粒体机制[D].复旦大学,眼科学,2013,博士.
[5]陶军,李应红,辛宇峰.控制系统故障树自动建造方法的研究[J].自动化学报,1997,06:104-109.
[6]王锦阳.缺血性脑卒中患者急性期血尿酸水平及与短期预后的相关性[D].河北医科大学,神经病学（专业学位）,2014,硕士.
[7]刘经伟.反胶束中糖化酶活性和稳定性的研究[D].广西大学,应用化学,2004,硕士.
[8]杨玉青,牛利勇,田立亭,黄梅,鲍谚,时玮.考虑负荷优化控制的区域配电网储能配置[J].电网技术,2015,04:1019-1025.
[9]曾源圣.机器视觉检测型材冷弯成形技术的研究[D].广东工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[10]白瑞.陕北地区中小学校建筑空间环境实态调查及节能策略研究[D].西安建筑科技大学,建筑学（专业学位）,2013,硕士.
[11]兰翔,鲍文娜,潘海峰,谢志鹏,张建国.根瘤菌BK-20固定化细胞生产L(+)-酒石酸[J].生物工程学报,2014,02:315-319.
[12]万光洁.天气雷达综合降水系统的数据插值功能实现[D].中国民用航空飞行学院,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[13]周凤.《格律的幽灵—美国自由体诗歌的文化和作诗法》中的专业词汇英译汉翻译经验探讨[D].兰州大学,笔译（专业学位）,2013,硕士.
[14]马正午.数字工业园开发与建设的关键技术[J].电气时代,2005,08:150-154.
[15]胡毓瑾.城市再生水资源利用项目的技术经济综合评价研究[D].西安建筑科技大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[16]程杰.结构形式与复合材料构成对70m舰船刚度的影响[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[17]董方.火针“火郁发之”法治疗急性期带状疱疹临床疗效研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[18]杨泽民,范全润.数据挖掘及其应用[J].雁北师范学院学报,2002,01:111-112.
[19]庄晓毅,张忠能.一种改进的关联规则挖掘算法[J].计算机工程,2004,14:128-129+135.
[20]邱振华,浣晓丹,罗岳平.水泥砂浆涂衬的金属元素渗析(下)[J].城市公用事业.1999(06)
[21]张梅莹.三焦经穴排刺治疗中风后上肢痉挛性瘫痪的临床研究[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2014,硕士.
[22]陈亦平.新型磷酸钙骨水泥的制备和性能研究[D].天津大学,材料学,2004,硕士.
[23]赵峥.甘肃省生态系统胁迫评估及生态恢复研究[D].西北师范大学,环境科学,2013,硕士.
[24]于洪敏.柴胡疏肝散加减治疗黄褐斑（肝郁气滞型）的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医外科学（专业学位）,2014,硕士.
[25]王丽丽.当代大学生文化自信缺失的表现及教育对策[D].华中师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[26]陈瑾.池塘表层底泥反硝化菌丰度与群落结构的研究[D].华中农业大学,渔业资源,2014,硕士.
[27]吴一凡.我国微型金融发展研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2013,硕士.
[28]江沈红.孔子、孟子、荀子思想与思想政治教育初探[D].武汉理工大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[29]钟强.基于键值存储的RTB广告买方平台的研究与设计[D].华中师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[30]孙萍.川梨实生株系的遗传多样性分析[D].浙江大学,园艺学,2013,硕士.
[31]刘翔,孙优贤.具有最优时域指标的有界控制器设计[J].自动化学报,2000,06:825-829.
[32]李玲玉.基于试验训练体系结构的地形环境资源开发[D].哈尔滨工业大学,仪器仪表工程,2013,硕士.
[33]李杰.雄激素受体基因核苷酸CAG重复多态对雄激素诱导前列腺癌细胞TMPRSS2:ERG基因融合的影响[D].重庆医科大学,外科学,2014,博士.
[34]葛萍.道安般若思想研究[D].安徽大学,中国哲学,2013,硕士.
[35]尹永成.对信用风险评估发展及我国商业银行信用风险评估问题的研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]孙亚菲.初中学困生的心理行为问题：隔代教育的调查证据[D].宁波大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[37]范珂.宜兴市人口结构变化分析[D].南京农业大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[38]刘智国.长沙-郴州成品油管道项目经济可行性研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[39]朱皆笑,许紫岳,王银儿.青年群体社会责任感影响因素的实证研究[J].浙江工业大学学报(社会科学版),2014,02:176-180.
[40]刘欢欢.供应链环境下基于顾客满意度的物流服务质量评价[D].南京大学,物流工程（专业学位）,2013,硕士.
[41]卢军.数据库与数据仓库下的统计分析[D].武汉理工大学,2004.
[42]马冰.论我国夫妻财产制契约规则的适用限度[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[43]刘凯.端部受冲击的胶接接头应力响应分析[D].三峡大学,机械工程,2013,硕士.
[44]方慧.《可持续室内设计》（第90-106页、154-177页）翻译项目报告[D].华中科技大学,翻译,2013,硕士.
[45]孙蕾.半焦催化松木锯末热解实验研究[D].华中科技大学,环境工程,2013,硕士.
[46]刘春玲.我国上市公司会计稳健性与审计质量相关性研究[D].云南财经大学,会计学,2013,硕士.
[47]冯志丰.基于文化地理学的广州地区传统村落与民居研究[D].华南理工大学,城市规划与设计,2014,硕士.
[48]冯小燕.洛阳中石化公司技能操作人员薪酬激励研究[D].河南科技大学,工商管理,2013,硕士.
[49]黄一,田玉平,冯纯伯.混合不确定性系统的鲁棒镇定及性能设计[J].自动化学报,1996,04:462-467.
[50]王慧娟.类型学视域中的项城方言被动句研究[D].浙江财经学院,汉语言文字学,2013,硕士.