Ghrelin对高糖诱导PC12细胞凋亡的抑制作用及其机制探讨

【摘要】目的：（1）探讨高糖环境对PC12细胞增殖生长的影响，并确定其半数抑制浓度和时间，观察细胞形态变化。（2）明确凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3的变化，用分子生物学的方法验证高糖是否诱导PC12细胞凋亡。方法：采用MTT比色法测定细胞的存活率。取对数生长期的PC12细胞，调整其密度为5×108/L。对照组PC12细胞在DMEM普通培养基（葡萄糖浓度4.5mg/mL）中进行培养，实验组的PC12细胞在9—27mg/mLDMEM高糖培养基中分别培养24—96h，测定出高糖环境作用PC12细胞的半数抑制浓度和最适时间点。之后的实验分为2组：（1）对照组（DMEM普通培养基中培养）；（2）高糖（HG）组（DMEM高糖培养基中培养）。采用光镜和透射电镜观察两组细胞的形态以及超微结构的改变。为进一步验证高糖有诱导PC12细胞凋亡的作用，通过RT-PCR和Westernblotting半定量检测凋亡相关凋亡因子Caspase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白水平的变化。结果：高糖在体外对PC12细胞增殖生长具有明显的生长抑制和促凋亡作用。PC12细胞经体外4.5—27mg/mL高糖培养基培养24—96h后，其促凋亡作用呈浓度依赖性和时间依赖性。随着高糖浓度的增加和干预时间的延长，其细胞增殖抑制率逐渐升高，在13.5mg/mLDMEM高糖培养基中培养72h后达到半数抑制率。与对照组比较，经13.5mg/mL高糖作用72h后，可见细胞数量明显减少，部分细胞出现凋亡现象，胞质中产生空泡，并出现凋亡小体。在RT-PCR和westernblotting实验中，与对照组相比，HG组Bcl-2的mRNA和蛋白表达的水平显著下降（p<0.05）；Caspase-3的mRNA和蛋白表达的水平显著升高（p<0.05）。结论：高糖条件可以抑制PC12细胞增殖生长，诱导细胞凋亡，其促凋亡作用呈浓度依赖性和时间依赖性。凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著下降，Caspase-3表达显著升高，进一步证明了高糖有抑制PC12细胞增殖和促凋亡的作用。目的：（1）探讨高糖和ghrelin对PC12细胞（神经元）增殖生长的影响。（2）从炎症的角度出发，用分子生物学的方法探讨ghrelin对高糖诱导PC12细胞凋亡抑制作用的相关分子机制。方法：实验分为4组：（1）对照组（DMEM普通培养基中培养）；（2）HG组（DMEM高糖培养基中培养）；（3）HG+ghrelin组（含有100ng/μLghrelin的DMEM高糖培养基中培养）；（4）HG+ghrelin+D-lys-3-GHRP-6组（含有100ng/μLghrelin和30g/LD-lys-3-GHRP-6的DMEM高糖培养基中培养）。用AnnexinV的方法测定各组细胞的凋亡率。为研究ghrelin是否通过TLR4/NF-κB信号通路发挥作用，选择该通路中重要的节点蛋白TLR4，MyD88，TRAF6和NF-κBp65，用RT-PCR和Westernblotting半定量检测细胞中该4种蛋白的mRNA和蛋白水平的变化。结果：高糖在体外对PC12具有明显的促凋亡作用，而ghrelin具有逆转高糖诱导细胞凋亡的作用。AnnexinV检测细胞凋亡的结果如下：HG组的PC12细胞凋亡率明显升高，与对照组相比具有显著统计学差异（p<0.05）；而HG+ghrelin组的细胞凋亡率明显下降，与对照组相比无统计学意义；加入ghrelin的特异性抑制剂D-lys-3-GHRP-6后，细胞凋亡率与对照组相比具有明显统计学意义（p<0.05）。在RT-PCR和westernblotting实验中，与对照组相比，TLR4，MyD88，TRAF6和NF-κBp65的mRNA和蛋白表达的水平在HG组明显升高（p<0.05），HG+ghrelin组与对照组相比无统计学意义，HG+ghrelin+D-lys-3-GHRP-6组TLR4，MyD88，TRAF6和NF-κBp65的mRNA和蛋白表达的水平明显升高，与对照组相比有统计学意义（p<0.05）。结论：ghrelin可以抑制高糖诱导的PC12细胞凋亡。其具体机制可能是：ghrelin下调了炎症相关通路——TLR4/NF-κB信号通路，尤其是减弱了NF-κB的活性，进而减少了细胞的凋亡。目的：（1）探讨高糖和ghrelin对PC12细胞生长周期的影响。（2）从细胞周期变化的角度出发，用分子生物学的方法验证ghrelin对高糖诱导PC12细胞凋亡的抑制作用的可能机制。方法：实验分为4组：（1）对照组（DMEM普通培养基中培养）；（2）HG组（DMEM高糖培养基中培养）；（3）HG+ghrelin组（含有100ng/μLghrelin的DMEM高糖培养基中培养）；（4）HG+ghrelin+IWR-1组（含有100ng/μLghrelin和10μmol/LIWR-1的DMEM高糖培养基中培养）。通过流式细胞术的方法检测以上各组PC12细胞生长周期的变化。为研究ghrelin是否通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，选择该通路中重要的节点蛋白phospho(p)-GSK3β，β-catenin和CyclinD1，分别用RT-PCR和westernblotting实验检测细胞中该3种蛋白的mRNA和蛋白水平的变化。结果：流式细胞术的结果显示，高糖环境可以打乱正常的PC12细胞周期，而ghrelin则可以逆转高糖的作用。与对照组相比，HG组中大量PC12细胞被阻滞在G0/G1期（p<0.05）；仅有少量PC12细胞可以进入S期和G2/M期（p<0.05）。在HG+ghrelin组中，被高糖打乱的细胞周期可以恢复正常，该组各期细胞比例与对照组相比无统计学意义。加入Wnt/β-catenin信号通路的特异性抑制剂IWR-1后，该组中各期PC12细胞比率与对照组相比具有明显统计学差异（p<0.05）。在RT-PCR和westernblotting实验中，与对照组相比，p-GSK3β，β-catenin和CyclinD1的mRNA和蛋白表达的水平在HG组明显降低（p<0.05），HG+ghrelin组与对照组相比无统计学意义，HG+ghrelin+IWR-1组表达明显下降，与对照组相比具有统计学意义（p<0.05）。结论：HG可以打乱细胞的正常生长周期。而ghrelin则可以逆转高糖的作用，它可以调节打乱的细胞周期。其具体机制可能是：ghrelin通过上调Wnt/β-catenin信号通路，增强了该通路下游细胞周期蛋白cyclinD1的表达，从而纠正了被高糖环境打乱的PC12细胞周期，减少了PC12细胞凋亡。
【作者】刘晓岩；
【导师】肖谦；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】PC12；高糖；凋亡；Bcl-2；Caspase-3；PC12细胞；ghrelin；炎症；TLR4/NF-κB信号通路；细胞周期；Wnt/β-catenin信号通路；

【参考文献】
[1]齐安宁.微型电动车电池管理系统研究及其硬件实现[D].青岛科技大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[2]郭敬东.热膨胀动态过程普遍性及其在高温超导体中的体现[D].中国科学院研究生院（金属研究所）,1996.
[3]王录芬.创新驱动中国光伏产业整合发展研究[D].西安科技大学,产业经济学,2014,硕士.
[4]肖红.雷帕霉素对HL-60细胞内PI3K/Akt/mTOR通路下游蛋白表达的影响[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[5]曲伟.某中型客车车架动态性能分析与结构优化[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.
[6]何丽娟.基于学习风格的听力策略训练的实证研究[D].山西财经大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[7]刘英杰.地铁环控通风系统消声降噪设备的分析与选择[J].现代城市轨道交通.2006(06)
[8]程娜娜.石墨烯修饰电极在电化学传感器和生物传感器中的应用研究[D].东北师范大学,分析化学,2012,硕士.
[9]余文珍.考虑信贷约束和背景风险的改进安全首要投资组合选择模型研究[D].宁波大学,数量经济学,2012,硕士.
[10]王纪学,王科志,杨洪强,黄喆.氧化石墨烯薄膜的光电化学性质[J].化学学报,2011,21:539-542.
[11]马晨.工业缝纫机气浮针杆的性能研究[D].西安工业大学,车辆工程,2014,硕士.
[12]韩振梅.网络信息资源的开发[J].天津成人高等学校联合学报,2005,05:6-8.
[13]罗丽华.板栗组织培养及褐变研究[D].中南林学院,植物学,2004,硕士.
[14]王兴茹.流程工业CIMS实施方案的研究[D].辽宁工程技术大学,2004.
[15]鲁克帅.南四湖沉积物细菌多样性研究[D].曲阜师范大学,生物化学与分子生学,2013,硕士.
[16]李亚楠.景观空间中肌理对人情感心理影响的研究[D].齐鲁工业大学,设计艺术学,2014,硕士.
[17]沈建兵.大学生体育运动心理障碍的对策研究[D].苏州大学,运动教育训练学（专业学位）,2013,硕士.
[18]王辉进.语言焦虑对高中学生英语学习的影响[D].福建师范大学,教育,2004,硕士.
[19]周伟贤.投资过度还是投资不足——基于A股上市公司的经验证据[J].中国工业经济,2010,09:151-160.
[20]柯清平,李广录,郝天歌,何涛,李雪梅.超疏水模型及其机理[J].化学进展,2010,Z1:284-290.
[21]李森.企业移动媒体平台的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[22]赖军.唐代壁画“三性”与当代壁画发展浅析[D].云南艺术学院,美术学,2013,硕士.
[23]李明波.成吉思汗陵园及旅游区文化旅游资源开发管理研究[D].内蒙古农业大学,公共管理,2013,硕士.
[24]单晓宇.慢性乙型肝炎患者肝脏的炎症程度与黑素瘤缺乏因子2表达程度的相关性研究[D].山东大学,内科学,2013,硕士.
[25]陈学华,贺振华,赵岩,钟文丽.叠前分角度道集的瞬时谱差异信息提取及应用[J].石油地球物理勘探,2012,01:89-94+188+195-196.
[26]苏杰.时滞系统的最大时滞界问题研究[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[27]张方方.浅析地方剧种宛梆衰落的原因[J].中国校外教育.
[28]孟茁.合成孔径雷达通信控制接口板的设计[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2010,硕士.
[29]刘颖.Ca～（2+）及质膜Ca～（2+）通透性通道参与蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光反应的实验证据[D].华东师范大学,植物学,2004,硕士.
[30]杨永强.山东乒乓球女队运动员运动损伤的调查分析及预防研究[D].山东体育学院,体育教学,2012,硕士.
[31]马荣峰.钻杆接头仿生抗疲劳研究[D].吉林大学,仿生科学与工程,2013,硕士.
[32]王献涛.电阻层析成像技术及其在微通道两相流中的研究[D].燕山大学,仪器仪表工程,2014,硕士.
[33]张旺,周跃云.基于结构分解法的北京市能源碳排放增量分析[J].资源科学,2013,02:275-283.
[34]肖曼.咳嗽变异型哮喘中医证型规律与诱导痰细胞学相关性研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[35]葛蓝.我国社会保险基金投资运营监管制度的法律问题研究[D].安徽大学,经济法学,2013,硕士.
[36]李虹霞.基于协同管理平台的企业知识管理系统的设计与实现[D].北京交通大学,2013.
[37]刘卫艳.长春市不同等级医院剖宫产率及剖宫产指征的分析[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[38]陈陆平,席裕庚,张钟俊.特征结构配置的并行方法[J].控制与决策,1996,01:73-76.
[39]陈天平.SENEX基因调控外周Treg细胞凋亡的临床和实验研究[D].安徽医科大学,内科学,2014,博士.
[40]涂飞.医患纠纷的法律解决途径[D].中南民族大学,法律,2013,硕士.
[41]王岩.新时期引进国外人才工作析论[D].吉林大学,公共管理,2004,硕士.
[42]沈祥云.清代文官保举制度研究[D].上海师范大学,中国近现代史,2004,硕士.
[43]魏兵.借鉴外国经验搞好中国电力工业改革[D].河北大学,世界经济,2003,硕士.
[44]谭玮璐.中美大学生英语演讲的语用标记语使用分析[D].山东大学,英语语言文学,2013,硕士.
[45]陈丹.A商业银行中小企业贷款业务问题研究[D].郑州大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[46]白润才.露天矿卡车实时调度优化决策系统及应用效果预测研究[D].辽宁工程技术大学,2005.
[47]茅洁,梅焰.灰色ART聚类分析法在竞技体育生化指标监控中的应用[J].武汉体育学院学报,2005,10:56-58.
[48]时春静.蒙汉杂居地区新农村文化建设问题研究[D].沈阳师范大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[49]张凯.锂硫电池正极改性、结构设计及电化学性能研究[D].中南大学,2014.
[50]来菊梅.环境约束下中国省际技术效率差异及影响因素研究[D].南京财经大学,数量经济学,2013,硕士.