VSTM1-V2在炎症反应调节中的功能研究

VSTM1-V2在炎症反应调节中的功能研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-08 分类:参考文献 喜欢:2238
师大云端图书馆

【摘要】机体固有免疫系统在宿主防御中发挥重要作用,中性粒细胞和单核/巨噬细胞是固有免疫系统中最重要的效应细胞。机体感染后他们立即激活并募集到感染部位,识别、吞噬和清除入侵病原体,同时分泌促炎介质,募集其他免疫细胞到达感染部位,激活机体适应性免疫系统。但是在清除病原体同时,也可能因免疫反应过度,导致严重的组织损伤,甚至引起致死性败血症休克,导致宿主死亡。免疫系统依靠多重机制调节这些过量激活的免疫反应,其中一个重要的机制是免疫细胞自身表达抑制性受体,抑制自身活性,平衡免疫反应。抑制性受体是免疫细胞上广泛存在的一类免疫反应负向调节器,这些受体与相应配体结合后,经由受体胞浆内尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs,ITIMs)向细胞转导抑制性信号,抑制细胞活性或提高细胞激活的阈值。这些抑制性受体在细胞吞噬、迁移、凋亡以及细胞因子产生等多方面调节免疫细胞活性,控制免疫应答。人类基因组中有300多个潜在的能够编码ITIMs的基因,其编码分子可能参与免疫细胞调控,但目前功能明确的只有1/5,大多数基因及其编码分子的功能仍不清楚,V组跨膜结构域包含物1(V-setandtransmembranedomaincontaining1,VSTM1)正是其中之一。目前关于VSTM1的功能报道很少。对其表达谱和DNA序列分析发现,VSTM1至少存在5种剪切体,VSTM1-V1~V5,其中VSTM1-V1和VSTM1-V2是主要表达形式。VSTM1-V1在正常组织和细胞中广谱表达,VSTM1-V2主要表达于免疫系统。VSTM1-V1为Ⅰ型膜蛋白,也称为白细胞信号抑制性受体-1(signalinhibitoryreceptoronleukocytes-1,SIRL-1),主要表达于人中性粒细胞和单核细胞上,其胞浆内尾部带有ITIMs,因此是一个潜在的天然免疫反应的抑制性受体,VSTM1-V2为经典分泌的糖蛋白,除了没有跨膜结构外,与VSTM1-V1序列完全一致,二者配体结合结构域完全一致,因此考虑VSTM1-V2与VSTM1-V1可能竞争结合配体。研究发现VSTM1-V1对巨噬细胞功能有抑制作用,而VSTM1-V2蛋白能促进外周血CD4+T细胞分泌IL-17A,也能促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化,而且在某些类风湿性关节炎患者血清中表达水平明显升高,因此可能与自身免疫病的发生和发展密切相关。目前对VSTM1-V2的研究是在适应性免疫调节方面,VSTM1-V2对固有免疫调节作用仍然未知。
【作者】李强;
【导师】李芳;
【作者基本信息】大连医科大学,病理学与病理生理学,2014,博士
【目的】通过体外炎症相关细胞培养以及急性炎症小鼠模型建立,研究VSTM1-V2在机体固有免疫尤其是抗病原体感染免疫中发挥的调节作用。
【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)和人单核细胞系THP-1细胞,以细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)-α作为阳性刺激物激活培养细胞。细胞分为正常对照(PBS)组、阳性刺激(TNF-α/LPS)组、不同浓度蛋白(VSTM1-V2)处理组、刺激物+不同浓度蛋白(TNF-α/LPS+VSTM1-V2)刺激组。MTT实验检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞增殖的影响;划痕实验检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs迁移的影响;测定细胞培养上清MPO活性和NO水平,明确VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞活性的影响;RT-PCR检测VSTM1-V1和VSTM1-V2基因在HUVECs中的转录情况以及VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞的促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)、趋化因子(IL-8、MCP-1、CXCL2等)以及细胞表面黏附分子(VCAM-1)的转录水平的影响;ELISA方法检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞培养上清中炎症介质表达和分泌的影响;Westernbloting方法检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞表达黏附分子(VCAM-1)、炎症因子(IL-6)以及细胞内信号分子JNK1和转录因子NF-κB(P65)的蛋白水平的表达,探讨VSTM1-V2可能的细胞内作用机制。以肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)气管内注射方法建立小鼠急性肺炎模型,尾静脉给予VSTM1-V2蛋白,实验小鼠分为正常(Normal)组、Kp组和Kp+VSTM1-V2组,设6h和12h两个时间点,在不同时间点采血、分离肺组织,HE染色观察VSTM1-V2蛋白对急性肺炎的影响,肺组织提取总RNA,real-timeqPCR方法检测细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2)表达,肺组织匀浆检测MPO及iNOS活性;流式细胞术微球阵列法检测VSTM1-V2蛋白对血清细胞因子(TNF-α、IL-6、MCP-1、和IL-10)的影响。
【结果】(1)HUVECs中有VSTM1-V1和VSTM1-V2表达,但表达量很低;TNF-α作用后VSTM1-V2表达相对VSTM1-V1增加,可能降低了由VSTM1-V1维持的细胞活化阈值,有利于细胞活化;VSTM1-V2刺激细胞后,VSTM1-V1相对VSTM1-V2增加更明显,细胞可能因活化阈值升高,活性被抑制;VSTM1-V2预处理后,再用TNF-α刺激,发现TNF-α刺激并没有明显改变VSTM1-V1和VSTM1-V2基因转录水平的比例;(2)HUVECs染色结果显示VSTM1-V2作用24h后,细胞数量明显少于PBS对照组,VSTM1-V2处理HUVECs48h后的MTT结果也显示,VSTM1-V2对HUVECs的生长有明显的抑制作用;(3)利用划痕实验检测VSTM1-V2对HUVECs迁移影响,结果显示与TNF-α单独作用组相比,VSTM1-V2与TNF-α联合作用24h后,对TNF-α诱导的HUVECs迁移有明显抑制作用,VSTM1-V2单独作用对HUVECs也有抑制作用;利用RT-PCR和Westernblotting方法检测HUVECs上黏附分子VCAM-1的表达,发现TNF-α可以促进HUVECs的表达,但这种作用被VSTM1-V2抑制;(4)RT-PCR检测IL-6、MCP-1、IL-8和CXCL2的mRNA表达,结果显示给予TNF-α刺激后,HUVECs表达的促炎因子和趋化因子mRNA水平均升高,但VSTM1-V2可以降低TNF-α诱导的HUVECs趋化因子的产生,但对促炎因子IL-6作用不明显;ELISA检测也发现,TNF-α作用后趋化因子CXCL2表达增加,但可以被VSTM1-V2抑制,Westernblotting检测IL-6的表达也有相同的表现;(5)检测VSTM1-V2作用后的HUVECs的NO产生,结果显示,VSTM1-V2与TNF-α共刺激HUVECs后,增加了NO的产生,提示VSTM1-V2对HUVECs的NO产生有影响;(6)Westernblotting方法检测VSTM1-V2作用后HUVECs内NF-κB(P65)和MAPK8(JNK1)表达变化,结果表明TNF-α诱导后P65和JNK1的增加都被VSTM1-V2所抑制,提示VSTM1-V2对TNF-α诱导的HUVECs活化的抑制作用,与NF-κB或MAPK信号转导途径相关,可能通过抑制转录因子P65和信号调节分子JNK1对HUVECs进行调节;(7)小鼠Kp急性肺炎模型中,HE染色后发现,VSTM1-V2对小鼠急性肺损伤有减轻或抑制作用;肺组织匀浆后,检测MPO和iNOS活性,结果显示给予VSTM1-V2蛋白组小鼠肺组织MPO和iNOS活性都低于模型组小鼠,提示急性肺损伤模型小鼠肺组织有中性粒细胞浸润且活性增强,而VSTM1-V2可以减弱这种损伤作用;(8)Real-timeqPCR检测肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2的mRNA的转录水平,结果显示,Kp组各种炎症因子表达水平远远高于正常组,而VSTM1-V2+Kp组与Kp组相比,各种炎症因子表达都明显降低(P<0.01),结果提示VSTM1-v2对急性肺损伤小鼠肺组织各种炎症因子有抑制作用;(9)流式细胞术微球阵列法检测VSTM1-V2蛋白对血清细胞因子的影响,结果显示与Kp组相比,VSTM1-V2+Kp组TNF-α、IL-6和MCP-1的各个时间点表达均降低(P<0.05),而IL-10各个时间点的表达均高于Kp组(P<0.05),结果提示Kp感染小鼠后,促炎细胞因子表达均升高,VSTM1-V2抑制了这些炎症介质的分泌;(10)但是VSTM1-V2对THP-1细胞的功能研究发现相反的作用,VSTM1-V2不仅对THP-1细胞聚集或相互黏附以及增殖发挥促进作用,而且也能促进LPS对THP-1细胞的活化作用;此外对THP-1的MPO活性测定也发现,VSTM1-V2促进THP-1细胞的MPO活性,而且随VSTM1-V2浓度的升高和时间的延长,THP-1的MPO活性增加,且上述作用可能与提高THP-1细胞内转录因子NF-κB(P65)水平相关。
【结论】(1)HUVECs上有VSTM1基因表达,TNF-α刺激HUVECs可以提高细胞VSTM1-V2基因转录,降低细胞活化阈值,促进HUVECs活化;VSTM1-V2可以提高HUVECs的VSTM1-V1基因转录,提高细胞活化阈值,抑制HUVECs活化;(2)VSTM1-V2对体外培养的HUVECs增殖有抑制作用,也对TNF-α诱导的HUVECs迁移、黏附分子表达及细胞因子产生有抑制作用;VSTM1-V2抑制TNF-α诱导的HUVECs激活作用与细胞内信号分子JNK1和转录因子NF-κB(P65)下调有相关性;(3)VSTM1-V2对小鼠Kp模型的免疫损伤有保护作用,可以抑制克雷伯杆菌引发的肺组织损伤和促炎因子的分泌;(4)VSTM1-V2对体外培养的THP-1细胞有促进作用,不仅直接促进THP-1的增殖、聚集及MPO活性增加,也能促进LPS诱导的活化作用,VSTM1-V2对HUVECs和THP-1细胞不同的作用,可能与不同细胞上VSTM1基因表达水平、配体分布水平及影响的信号转导通路不同有关。
【关键词】VSTM1;SIRL-1;抑制性受体;可溶性受体;免疫调节;

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