Gadd45b对大鼠脑缺血后轴突可塑性和运动功能恢复的调控机制研究

【摘要】背景与目的：缺血性脑卒中是世界范围内引起死亡和瘫痪的主要病因，并给家庭和社会造成沉重的经济和社会负担。目前仍缺乏有效的治疗药物帮助脑卒中患者恢复受损的神经功能。成年动物大脑损伤后脑组织神经可塑性有限，脑卒中患者常遗留有明显的神经功能障碍。促进大脑神经可塑性是促进缺血性脑损伤后神经功能恢复的重要途径。近年来多项研究发现生长抑制与DNA损伤修复基因b(growtharrestandDNA-damageinduciblegeneb,Gadd45b)可能为影响神经可塑性相关基因，Gadd45b极有可能成为具有治疗潜力的分子指标。本研究探讨调控内源性Gadd45b表达对实验性缺血性卒中后轴突可塑性和运动功能恢复的影响及其信号调控通路，同时研究小脑顶核电刺激对脑梗死后内源性Gadd45b表达及其神经功能恢复的影响，为脑梗死后神经功能康复病理生理机制的了解和临床干预提供理论基础。方法：第一部分：构建针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体，并检测该RNA干扰载体的转染效率和干扰效率。将高、中、低三种不同滴度(剂量)的慢病毒载体和阴性对照病毒载体立体定向至大鼠脑组织。采用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表达；采用荧光定量PCR(Q-PCR)检测三种不同滴度慢病毒载体对大鼠脑组织Gadd45bmRNA的抑制效率。通过以上检测筛选出慢病毒载体的最佳转染滴度。第二部分：采用大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)建立成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠实验性缺血性卒中模型。通过立体定向脑内注射生物素葡聚糖胺(biotinylateddextranamine,BDA)追踪MCAO大鼠皮质红核束(corticorubraltract,CRT)的新生神经轴突出芽。通过检测生长相关蛋白43(Growthassociatedprotein-43,GAP43)表达变化反映脑缺血后轴突再生。采用“楼梯测试”和“平衡木实验”评价大鼠脑缺血后瘫痪前肢运动功能。我们采用RNA干扰技术抑制内源性Gadd45b表达研究其对MCAO模型大鼠轴突可塑性和运动功能恢复的影响。第三部分：采用MCAO建立成年大鼠实验性缺血性卒中模型。采用RNA干扰抑制大鼠脑内Gadd45b内源性表达。通过免疫组化、Q-PCR和WesternBlot分别检测脑缺血后2天和14天脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)的免疫反应、mRNA和蛋白表达水平。通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、免疫组化和WesternBlot检测大鼠脑缺血后2天和14天缺血侧脑组织cAMP/PKA/pCREB信号通路表达水平。采用Q-PCR和WesternBlot分别检测脑缺血后2天和14天ROCKmRNA和蛋白表达水平。藉此探讨Gadd45b调控轴突可塑性的信号调控通路。第四部分：采用MCAO建立成年SD大鼠实验性缺血性卒中模型。脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)后立即给予1小时小脑顶核电刺激(fastigialnucleuselectrostimulation,FNS)研究其对大鼠脑缺血后Gadd45b表达和神经功能恢复的影响。采用免疫组化、Q-PCR和Westernblot检测Gadd45b表达水平。藉此研究小脑顶核电刺激对脑梗死后Gadd45b表达变化的影响，探讨小脑顶核电刺激应用于临床促进脑梗死后功能康复的分子机制。结果：第一部分：成功构建出针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体。激光共聚焦结果显示，高、中、低三种不同剂量组大鼠皮层和海马组织注射点周围均出现GFP阳性表达。高滴度和中滴度组GFP阳性表达高而低滴度组GFP阳性表达较低。Q-PCR结果显示，与正常对照组相比，高滴度和中滴度组Gadd45bmRNA表达下降超过70%(P<0.05),高滴度和中滴度组之无明显差异(P>0.05)，低滴度组与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。第二部分：免疫荧光结果显示，与假手术组(sham)相比，脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组(LV-Control)与缺血组(MCAO)相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组(LV-shGadd45b)大鼠GAP43阳性细胞数则明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Westernblot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠GAP43mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。BDA神经示踪结果显示，与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠脑缺血后皮质红核束代偿性的新生轴突明显下降(P<0.05)。与单纯缺血组相比，Gadd45b-RNAi干预处理明显抑制大鼠脑缺血后的运动功能恢复(P<0.05)。第三部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d及14d缺血侧皮质BDNF阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠BDNF阳性细胞数明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Westernblot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质BDNFmRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠BDNFmRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。免疫组化结果显示，与假手术组相比，脑缺血后2d及14d缺血侧皮质PKA和pCREB阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠PKA和pCREB阳性细胞数均明显下降(P<0.05)。ELISA结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质cAMP和PKA蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠cAMP和PKA蛋白水平明显下降(P<0.05)。Westernblot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质pCREB蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠pCREB蛋白水平明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Westernblot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质ROCKmRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠ROCKmRNA和蛋白水平进一步明显增加(P<0.05)。第四部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数在缺血后6h至3d均表达升高(P<0.05)，缺血组和假刺激组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数进一步增加(P<0.05)。Q-PCR和Westernblot结果显示，与假手术组相比，大鼠Gadd45bmRNA和蛋白水平在脑缺血再灌注后6h开始增加，24h达高峰，3d下降到比较低的水平但仍高于假手术组(P<0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠Gadd45bmRNA和蛋白水平在脑缺血后各时间点进一步明显增加(P<0.05)。此外，与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠脑缺血损伤后神经功能评分显著下降(P<0.05)。结论：慢病毒载体能高效地转染大鼠脑组织，有效地进行大鼠Gadd45b特异性shRNA基因转导。Gadd45b-RNAi有效抑制了大鼠脑组织内源性Gadd45b表达。Gadd45b-RNAi干预处理同时还抑制cAMP/PKA/pCREB信号通路激活并促进ROCK表达。因此，Gadd45b可通过调控BDNF-cAMP/PKA-CREB信号通路激活抑制ROCK通路，从而对脑缺血后的轴突可塑性发挥作用。脑缺血后电刺激小脑顶核可能是通过激活Gadd45b促进功能恢复。
【作者】刘彬；
【导师】李长清；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】Gadd45b；RNA干扰；BDNF；轴突可塑性；功能恢复；

【参考文献】
[1]齐啸.北京市男男性行为者HIV感染和固定性伴检测研究[D].河北医科大学,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[2]易川.上海市营利性青少年体育类夏令营现状与对策研究[D].上海师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[3]甘卓慧.脑缺血及再灌注过程中的一氧化氮扩散反应动力学研究[D].浙江大学,生物医学工程,2004,硕士.
[4]崔娟娟.《宁夏回族文化图史》（节选）翻译实践报告[D].宁夏大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[5]吴道长.多重自然逆境条件下小花棘豆生理生化特性研究[D].西北大学,细胞生物学,2014,硕士.
[6]郭爱华.应用《中国老年人膳食指南》对老年人营养KAP干预效果研究[D].吉林大学,护理学,2013,硕士.
[7]张平.基于SPA的Rough集——一种数据挖掘的新方法[D].浙江工业大学,2001.
[8]梁英.应用数据挖掘进行客户关系管理[J].湖南商学院学报,2004,05:44-46.
[9]都颖,陈海杰,成中军,来华,张乃庆,孙克宁.分子自组装法制备具有可控浸润性的铜表面[J].高等学校化学学报,2014,01:105-109.
[10]郭雪梅.透过形象解析天国之爱与世俗之爱[D].山东大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[11]郑明远.轨道交通与城市空间整合规划方法论研究[D].北京交通大学,2012.
[12]黄书宁.中国可再生能源与经济增长关系研究[D].浙江工商大学,统计学,2012,硕士.
[13]彭英.CRM管理及其在电信企业信息化管理中的应用——镇江电信客户关系管理问题研究[D].南京理工大学,2002.
[14]叶慧.豪斯翻译质量评估模式在翻译竞赛作品评估中的应用研究[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[15]李梦妍.基于交替传译记忆机制的笔记训练[D].南京航空航天大学,英语语言文学,2013,硕士.
[16]孙华泽.晚清民初“现代文学教育”的发生[D].东北师范大学,文艺学,2014,博士.
[17]刘君强,孙晓莹,杨传明,周志刚.移动式数据挖掘平台模型[J].微电子学与计算机,2003,08:82-84+103.
[18]孙连捷,谷玉兰.2005年注册安全工程师执业资格考试辅导讲座——生产安全事故案例分析(2)[J].劳动保护.2005(08)
[19]刘承军.首钢矿业球团厂二系列链篦机机速实现自动控制[J].冶金自动化,2013,03:6.
[20]孟玉宁.宏观一维石墨烯材料的制备及应用研究[D].北京理工大学,2014.
[21]范慧敏.社区失能老人居家照护者的社会支持系统研究[D].重庆大学,行政管理,2014,硕士.
[22]马驰.货币政策对我国上市银行经营绩效影响研究[D].江西财经大学,金融学,2013,硕士.
[23]郑浩,隋成华,王河林,魏高尧,姚铖.角膜地形图仪中调焦函数的选取及搜索方法[J].光学仪器,2013,03:25-31.
[24]刘鹏.常压化学气相沉积法二氧化钛薄膜的制备与掺杂性能研究[D].浙江大学,材料物理与化学,2004,硕士.
[25]申雷.茶多酚分子修饰改性及其对中式培根抗氧化作用的研究[D].南京农业大学,食品科学,2011,硕士.
[26]周阳.薄板对接焊缝的超声检测信号解卷积消噪技术研究[D].哈尔滨理工大学,材料加工工程,2012,硕士.
[27]陈怡欣,萧德云.一种基于扩张原理的模糊模型及其辨识方法[J].自动化学报,1999,06:743-749.
[28]翟美.铝用预焙阳极焙烧炉节能低排放新技术研究[D].湖南大学,材料工程,2013,硕士.
[29]程晓荣.初三英语阅读焦虑现状调查与对策研究[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[30]田琳.书法家的自我教育研究[D].山西师范大学,美术学,2013,硕士.
[31]郭曙光.基于OpenGLES的手机蓝牙联网游戏的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[32]徐伟敏.补阳还五汤治疗腰椎后路术后腰背肌损伤的动物实验与临床研究[D].福建中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[33]吴登能.面向移动互联网的个性化新闻推荐算法研究[D].杭州师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[34]赵欢.介孔TiO_2复合光催化剂的制备及光催化降解染料废水的研究[D].长安大学,市政工程,2013,硕士.
[35]王立秀.船舶融资租赁风险评价与控制研究[D].重庆交通大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[36]黄宴委.基于核岭回归的非线性内模控制[J].控制与决策,2009,07:1100-1103.
[37]王琳.主成分回归与分位数回归在两类数据中的应用研究[D].哈尔滨工业大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[38]钱立军,赵韩,鲁付俊.基于CAN总线的混合动力汽车控制系统[J].农业机械学报.2004(06)
[39]胡思帆.新疆额尔齐斯河贝加尔雅罗鱼线粒体基因组分析和遗传多样性研究[D].华中农业大学,水产养殖,2014,硕士.
[40]林业星.曝气铁碳内电解—改性茶渣处理电镀废水[D].扬州大学,环境科学,2011,硕士.
[41]王蓉.肝星状细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建与鉴定[D].华中科技大学,消化内科,2013,硕士.
[42]刘文英.汽车电子产品电磁兼容性(EMC)分析、仿真及优化设计[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[43]王赕.四川会理拉拉铁氧化物—铜—金—铀（IOCG）矿床稳定同位素地球化学研究[D].成都理工大学,地球化学,2013,硕士.
[44]范丽娟.基于传热学分析的金属零件缺陷电磁激励红外热成像检测方法[D].华东交通大学,精密仪器及机械,2013,硕士.
[45]金锐光.PUFA材料用于钢筋混凝土梁抗剪加固的试验研究与理论分析[D].哈尔滨工业大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[46]张立魁.基于VAR模型的我国财政政策非凯恩斯与非对称效应检验：1994-2010[D].浙江财经学院,财政学,2013,硕士.
[47]周慧江.复发性肝癌的早期诊断和治疗分析[D].浙江大学,外科学,2004,硕士.
[48]郑满满.改进的各向异性扩散图像去噪模型[D].重庆大学,计算数学,2014,硕士.
[49]王引娣.基于扩频技术的DORIS系统研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[50]徐睿.唐代御史台审判职能研究[D].南京师范大学,法律史,2012,硕士.