RNAi介导的NAMPT基因表达抑制对胰岛素抵抗与动脉粥样硬化的作用及机制研究

【摘要】第一部分RNAi介导的NAMPT基因表达抑制对C57BL/6J小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响目的探讨NAMPT基因表达抑制对C57BL/6J小鼠糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响。方法40只健康雄性的C57BL/6J小鼠，鼠龄7周，适应性喂养1周，随机分为普食喂养组（NF组，n=10），高脂喂养组（HF组，n=10）；高脂+pAd-GFP组（GFP组，n=10），高脂+pAd-shNAMPT组（shNAMPT组，n=10），均喂养12周。于11W末分别给予GFP和shNAMPT组小鼠尾静脉注射pAd-GFP或pAd-shNAMPT。3d后行颈动静脉导管置入术，术后各组小鼠适应性喂养3天。采用扩展高胰岛素正葡萄糖钳夹术（示踪剂为3-3H标志的葡萄糖）评价糖脂代谢及胰岛素抵抗变化。结果HF组、GFP组和shNAMPT组肝脏组织NAMPTmRNA和蛋白表达及血浆NAMPT蛋白表达均较NF组明显降低(均P<0.01），且shNAMPT组肝脏组织NAMPTmRNA和蛋白表达及血浆NAMPT蛋白表达明显低于HF组和GFP组(均P<0.01）。三组高脂喂养的C57BL/6J小鼠体重、空腹血糖（FBG）、血浆胰岛素（Fins）、血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、和肝脏TC、TG水平均明显高于NF组，（均P<0.01），而shNAMPT组与HF组和GFP组比较，HDL-C和Fins水平增高（P<0.05或P<0.01），肝脏TC明显降低（P<0.05）。钳夹稳态时，shNAMPT组HDL-C虽被抑制，但仍明显高于NF组、HF组和GFP组（均P<0.01）。在相同的高胰岛素输注下，NF组的葡萄糖输注率(GIR)明显高于HF组、GFP组和shNAMPT组（均P<0.01），shNAMPT组的GIR与HF组和GFP组相比虽轻度降低，但差异无统计学意义。钳夹结束时，三组高脂喂养小鼠的葡萄糖清除率（GRd）明显低于NF组（均P<0.01），而肝糖输出率（HGP）明显高于NF组（均P<0.01）；shNAMPT组的GRd轻度低于HF组和GFP组，其HGP轻度高于HF组和GFP组，但均无统计学意义（均P>0.05）。结论高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠可诱导类似人类T2DM生理特点的胰岛素抵抗模型。NAMPT基因抑制对高脂诱导C57BL/6J小鼠产生的胰岛素抵抗无影响。第二部分RNAi介导的NAMPT基因表达抑制对动脉粥样硬化的影响及机制研究第一节NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠脂代谢和动脉粥样硬化的影响目的探讨NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠脂代谢及动脉粥样硬化的影响方法48只雄性的ApoE-/-小鼠，鼠龄7周，适应性喂养1周，随机分为高脂喂养+PBS组（PBS组，n=10），高脂+pAd-GFP组（GFP-A组，n=10）和高脂+pAd-shNAMPT组（NAMPT-A组，n=10），均喂养12周。PBS组、GFP-A组和NAMPT-A组于高脂喂养的第8周末和10周末分别给予尾静脉注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。RT-PCR和westernblot检测NAMPT的基因及蛋白表达。酶法检测各组小鼠血脂和肝脏脂质。用HE检测小鼠主动脉窦部的斑块面积；用油红O和天狼星红苦味酸染色分别检测小鼠主动脉窦部斑块中的脂质和胶原含量；用油红O染色法检测小鼠降主动脉的中性脂肪含量。结果NAMPT-A组肝脏组织NAMPTmRNA和蛋白表达水平及血浆NAMPT蛋白表达均明显低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01）。NAMPT-A组血浆HDL-C水平明显高于PBS组和GFP-A组，而肝脏组织的TC低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01或P<0.05）。与PBS组和GFP-A组相比，NAMPT-A组主动脉窦部的斑块面积和中性脂肪含量明显降低，而斑块中的胶原含量明显升高(均P<0.01)。NAMPT-A组降主动脉的中性脂肪含量明显低于PBS组和GFP-A组(均P<0.01)。结论NAMPT基因表达抑制能明显减少斑块面积，增加斑块纤维化，使斑块趋于更稳定的表型。NAMPT基因表达抑制可能具有抗动脉粥样硬化的作用。第二节NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠巨噬细胞胆固醇逆转运的体内研究目的探讨NAMPT基因表达抑制对ApoE-/-小鼠巨噬细胞胆固醇逆转运的影响及机制研究方法24只雄性的ApoE-/-小鼠，鼠龄7周，适应性喂养1周，随机分为高脂喂养+PBS组（PBS组，n=8），高脂+pAd-shGFP组（GFP-A组，n=8）和高脂+pAd-shNAMPT组（NAMPT-A组，n=16），均喂养12周。PBS组、GFP-A组和NAMPT-A组于高脂喂养的第8周末和10周末分别给予尾静脉注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。于第12周腹腔注射经ac-LDL和3H-cholesterol处理过的RAW264.7巨噬细胞悬液（0.5ml/鼠，细胞数达4.5×106，放射活性6.4×106cpm）。快速蛋白液相色谱法分离血浆脂蛋白及酶法检测胆固醇含量。液体闪烁计数法测定小鼠血浆、肝组织及粪便的3H含量。RT-PCR和westernblot检测肝脏的NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因及蛋白表达。结果FPLC及酶法分析显示NAMPT-A组小鼠血浆HDL（峰值26-31）中的胆固醇含量高于PBS组和GFP-A组。NAMPT-A组小鼠6h、24h及48h血浆3H含量较PBS组和GFP-A组显著增多，占注射总量的百分比分别为（6h1.46±0.36VS1.11±0.22，1.10±0.23），（24h5.01±0.83VS3.5±0.44，3.55±0.62），（48h5.26±0.95VS3.79±0.75，3.81±0.88），（P<0.05或P<0.01）。NAMPT-A组小鼠肝脏3H含量较PBS组和GFP-A组显著增多（6.88±0.79VS3.88±0.72，3.92±0.73），（均P<0.05），粪便的3H含量显著增多（9.85±2.01VS6.29±1.26，6.31±1.32），（均P<0.05）。与PBS组和GFP-A组相比，NAMPT-A组小鼠肝脏的PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因和蛋白表达均明显升高（均P<0.01）。结论NAMPT基因表达抑制可能通过上调肝脏PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因的表达，促进小鼠体内巨噬细胞胆固醇逆向转运。第三节MK866介导的NAMPT基因表达抑制对细胞胆固醇流出的分子机制研究目的探讨NAMPT基因表达抑制对小鼠巨噬细胞胆固醇流出的影响及机制研究方法（1）用Ad-GFP或Ad-shNAMPT干预3H-cholesterol标记的巨噬细胞，然后用含有HDL的培养基孵育，LSC法测定细胞胆固醇流出；（2）以Ad-GFP或Ad-shNAMPT干预RAW巨噬细胞和Hepa1-6肝细胞，然后用MK866（PPARα抑制剂）干预。酶法测定细胞内的TC含量。RT-PCR和westernblot检测两种细胞NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因和蛋白表达。结果1.与Ad-GFP相比，Ad-shNAMPT干预后巨噬细胞和肝脏细胞NAMPT基因及蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。2.Ad-shNAMPT干预明显促进体外培养巨噬细胞的胆固醇流出（P<0.01）。3.与Ad-GFP相比，Ad-shNAMPT干预降低RAW和Hepa1-6细胞内TC含量，MK866抑制这种效应（均P<0.05）；与Ad-GFP相比，Ad-shNAMPT干预升高RAW和Hepa1-6细胞的PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因和蛋白表达，而这种效应能被MK866抑制（P<0.05或P<0.01）。结论NAMPT基因表达抑制可能通过激活PPARα-LXRα-ABCA1/ABCG1通路，促进小鼠巨噬细胞胆固醇流出和降低细胞内的TC含量。
【作者】王葱；
【导师】杨刚毅；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】NAMPT基因抑制；糖脂代谢；胰岛素抵抗；扩展高胰岛素正葡萄糖钳夹术；脂代谢；动脉粥样硬化；胆固醇逆转运；胆固醇流出；

【参考文献】
[1]甘俊民,曹熙纯.常减压塔的不锈钢衬里及其施工方法[J].石油化工设备.1992(06)
[2]李调军.浅水域勘探中的串道接收法[J].石油地球物理勘探,1980,S1:81-84.
[3]杨文红.旅行社网络化经营体系构建研究[D].青岛大学,旅游管理,2004,硕士.
[4]杨凌寒.真空包装盐水鹅绿变原因及防控技术研究[D].南京农业大学,食品科学,2012,硕士.
[5]曹全.地铁隧道在顶进式公铁立交桥下通过时技术处理的分析和探讨[J].中国铁路.2005(06)
[6]庄蕊蕊.上海市电影院商业同业公会研究（1945-1956）[D].华中师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[7]梁旭辉.可持续发展观与哲学范式的转换[D].华东师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[8]茌家梁.学案导学在不同课型实施的有效性研究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[9]尹旭庆.HIF-1 α和VEGF在恶性纤维组织细胞瘤中的表达及其与肿瘤微血管生成的关系[D].济南大学,外科学,2012,硕士.
[10]崔兆芳.新生儿呼吸衰竭的高频振荡通气时机及早期氧合参数监测意义的探讨[D].青岛大学,儿科学,2013,硕士.
[11]刘笑菲.机翼共形全极化阵列雷达自适应抗干扰与误差校正方法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[12]沈博文.肺经咳嗽病症脉解[D].北京中医药大学,中医诊断学,2013,硕士.
[13]王明昊,刘刚,赵鹏涛,杨述华.多胞约束LPV系统多面体不变集RMPC算法[J].控制与决策,2013,11:1661-1666.
[14]薛燕.我国住房公积金制度存在问题及对策研究[D].云南财经大学,公共管理,2013,硕士.
[15]高玉芳,于维民,宋司兵.大型板坯连铸机香蕉座有限元分析[J].一重技术.2001(01)
[16]赵玛丽.基于生命周期理论视角的以房养老问题研究[D].浙江大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[17]杨梅玉.蚯蚓堆制处理玉米秸秆机理研究[D].吉林大学,发酵工程,2014,硕士.
[18]张英.HIV-1感染者血清IL-18、IL-18BP水平的测定及临床意义[D].桂林医学院,内科学,2012,硕士.
[19]崔苏琴.内蒙古呼和浩特市高层居住区绿地景观现状分析及评价研究[D].内蒙古农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[20]李如松.端铣平面和铣头主轴的倾斜安置[J].组合机床与自动化加工技术.1992(07)
[21]其木格.蒙古国学生汉语形容词重叠形式习得研究[D].华东师范大学,对外汉语教学,2012,硕士.
[22]郭建军,王文胜,孙明政,王迷军.上庄矿区岩体结构调查及潜在破坏模式分析[J].有色金属(矿山部分).2006(01)
[23]马明秀.共同体领导理论研究[D].南京师范大学,教育领导与管理,2012,硕士.
[24]于志良.基于空间激光通信的光混沌保密系统理论与方法研究[D].华中科技大学,信息安全,2013,硕士.
[25]朱建.公安局网络警察服务平台管理信息系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[26]赵玉章.关于电子商务中改进DSS决策系统的分析[J].商业研究,2004,01:168-170.
[27]张红.物联网技术在智能建筑能源管理中应用的研究[D].长安大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[28]李方毅.在金属（Au，Ag）和氧化物（Fe_3O_4，CoO，and CeO_2）纳米粒子中蛋白纳米粒子冠状物的硬化[D].吉林大学,生物工程,2013,硕士.
[29]徐良.《钱江晚报》“杭州地铁开通”专题报道研究[D].浙江大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[30]张奇.高压直流输电换相失败解决方法的研究[D].兰州理工大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[31]包东智.WLAN的市场发展[J].信息网络.2004(07)
[32]王福棠.基于XML的WEB服务中间件技术[D].西北工业大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[33]张志新.结合空域的频谱资源管理[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[34]郭宸孜.卫星光通信中基于二元光学元件的信标光发射技术研究[D].哈尔滨工业大学,物理电子学,2013,硕士.
[35]谢达.基于超声波传感器的风速测量方法研究[D].黑龙江大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[36]韩莉.幼儿园班级活动区创设的有效性研究[D].西南大学,学前教育学,2014,硕士.
[37]孙长春.加工中心用B轴车铣复合单元的总体设计[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[38]孙钰.论独立学院金融专业学生定量分析能力的培养[J].中小企业管理与科技(下旬刊),2014,06:247-248.
[39]彭飞.电子互动绘本的设计艺术研究[D].华中师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[40]郭晓亮.鸡瘟毒清抗鸡新城疫病毒作用机理的研究[D].东北农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[41]师岚.网络言论的传播与管理[D].吉林大学,新闻学,2004,硕士.
[42]石岩.新课程背景下小学校长课程管理研究[D].内蒙古师范大学,2005.
[43]韩林飞,郭建民.屋顶绿化是治理雾霾的重要方法[J].中国建筑防水,2014,11:24-27.
[44]王丹.基于荧光纳米粒子的一些生物功能成像研究[D].浙江大学,2013.
[45]裴秋水.越南广宁省云屯岛县文化旅游发展研究[D].广西师范大学,旅游管理,2013,硕士.
[46]周佩.基于多核DSP并行调度机制的实现[D].中国科学院研究生院（光电技术研究所）,信号与信息处理,2014,硕士.
[47]徐娇.山东省职工运动会排舞比赛成套动作技术水平分析[D].山东师范大学,体育（专业学位）,2013,硕士.
[48]万可慧.牛肉干制品中杂环胺的形成与控制研究[D].南京农业大学,食品科学,2013,硕士.
[49]王昭.利用QCM-D监控生物分子在材料表面的吸附行为[D].西南交通大学,材料工程,2014,硕士.
[50]王爽.英语专业学生写作策略使用的性别差异研究[D].华中师范大学,英语语言文学,2012,硕士.