补肾法、疏肝法对体外培养小鼠卵泡发育过程中卵母细胞GDF-9及其Smads信号通路影响的研究

【摘要】目的：针对体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)中妊娠率低、流产率高等问题，在前期研究证实补肾法、疏肝法具有提高临床妊娠率、改善妊娠结局、提高卵母细胞质量作用的基础上，研究补肾法、疏肝法在小鼠体外卵泡发育过程中对卵母细胞GDF-9及其信号通路的调控作用，以探讨两法改善卵母细胞质量的作用机制，比较两法作用机制及作用环节之异同。方法：含药血清制备：取28只6周龄健康雌性SD大鼠按体重随机分为7组:疏肝低剂量组、疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、补肾中剂量组、补肾高剂量组、空白组。实验用逍遥丸为河南宛西制药股份有限公司生产，将48粒逍遥丸溶于100ml蒸馏水中制成混悬液，混悬液含生药0.18g/ml。补肾调经方所需药材一次性购自石家庄市乐仁堂药店，并由本校中药系制成口服液，口服药含生药1.62g/ml。空白对照组每日灌服生理盐水2ml/100g体重；补肾调经方组高、中、低剂量组和疏肝高、中、低剂量组每日灌服补肾调经方和逍遥丸3ml/100g体重、2ml/100g体重、1ml/100g体重(分别相当于成人剂量的18倍、12倍、6倍，每日分两次给药，连续4天。于末次给药后1h大鼠股动脉采血。室温静置2h离心(3000rpm,10min)，取上清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm无菌滤器过滤除菌，得补肾调经方、逍遥丸低、中、高剂量大鼠含药血清和正常大鼠血清，-20℃保存备用。选用出生D12昆明乳鼠432只，分3批进行实验，每批144只，随机分为8组：补肾低剂量组、补肾中剂量组、补肾高剂量组，疏肝低剂量组、疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、正常组、空白组，每组18只(3批每组共54只)。分离窦前卵泡：采用机械法分离。将昆明乳鼠颈椎脱臼处死，取出双侧卵巢，用含青、链霉素各200IU/mL的α-MEM培养液清洗1-2次，在带有目镜标尺的体视显微镜下用针头对卵巢进行分离，选择直径在80-120μm之间的窦前卵泡。窦前卵泡培养：35mm培养皿中置2ml培养液，37℃、5%CO2(V/V)、100%湿度培养，24h后卵泡贴壁。分别加入补肾调经方和逍遥丸大鼠含药血清，分为补肾组和疏肝组，补肾含药血清组与疏肝含药血清组分别设置低、中、高三个剂量组，正常大鼠血清为正常组，不加血清为空白组。培养6d，隔天换液1/2；0.25%胶原酶消化窦前卵泡，分离得卵母细胞，第一批置于液氮速冻后-80℃保存备用(用于实时荧光定量PCR)。第二批迅速放入2%多聚甲醛中固定(用于免疫组化)。第三批迅速放入2%多聚甲醛固定(用于免疫荧光)。通过倒置显微镜观察卵泡形态及成活数；采用实时荧光定量PCR检测GDF-9、BMPRII、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表达；采用免疫组化法、免疫荧光法检测卵母细胞中上述指标蛋白的表达。结果：1卵泡生长过程中形态及结构变化体外培养第2天，窦前卵泡贴壁，固定于培养皿底，不能移动；第4天卵泡颗粒细胞数目明显增多，培养皿底平铺一层细胞；第6天颗粒细胞层数增多，颗粒细胞越过卵泡基底膜生长，卵泡逐渐失去球形的三维结构，转变成为煎蛋样外观。消化卵泡膜细胞及颗粒细胞后，可见卵母细胞。2空白组、正常组、疏肝及补肾各剂量组窦前卵泡成活数的比较在卵泡的体外培养过程中，D2各组卵泡成活数比较，疏肝高剂量组及补肾高剂量组较其它各组成活数均有增高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)；D4各组卵泡成活数比较，疏肝高剂量组、补肾中剂量组及补肾高剂量组较其它各组均有增高趋势，其中补肾高剂量组卵泡成活数较其它各剂量组均增高且有统计学意义(P＜0.05)。在体外培养D6，与空白对照组比较，正常组卵泡成活数有增多趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)；与空白对照组比较，疏肝低、中、高剂量组和补肾低、中、高剂量组的卵泡成活数增高，差异有统计学意义(均P＜0.05)；与正常组比较，补肾各剂量组和疏肝各剂量组的卵泡成活数均升高，其中补肾高剂量组卵泡成活数最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余依次为疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、补肾中剂量组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；疏肝低剂量组及补肾低剂量组间无统计学差异(P＞0.05)。3各组体外培养小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表达3.1体外培养不同时间点各剂量组间GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表达空白组及正常组：与D2比较，D4、D6GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)。疏肝各剂量组：与D2比较，D4、D6GDF-9mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；BMPRⅡ、ALK5mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；与D2比较，D4、D6Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。补肾各剂量组：与D2比较，D4、D6GDF-9mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；BMPRⅡ、ALK5mRNA表达均降低(P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；D2、D4、D6Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义。3.2各组之间小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表达在体外培养的D2、D4、D6：正常组较空白组卵母细胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达均有升高趋势，但差异无统计学意义(均P＞0.05)；与空白组、正常组比较，疏肝低、中、高剂量组卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达均升高(均P＜0.05)；且疏肝中剂量组GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达高于疏肝高剂量组及疏肝低剂量组(均P＜0.05)；疏肝高剂量组表达高于疏肝低剂量组(P＜0.05)。与正常组、空白组比较，补肾低、中、高剂量组的卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达升高(均P＜0.05)；且补肾高剂量组GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达较补肾中、低剂量组均升高(均P＜0.05)，呈剂量依赖性。疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较，补肾高剂量组卵母细胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4mRNA的表达高于疏肝中剂量组，其次各组表达由高至低依次为补肾中剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、疏肝低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。各治疗组之间ALK5mRNA表达比较，补肾高剂量组表达最强，差异有统计学意义(P＜0.05)，其次依次是疏肝中剂量组、补肾中剂量组、补肾低剂量、疏肝高剂量组、疏肝低剂量组。各治疗组之间BMPRⅡmRNA表达比较，疏肝中剂量组表达最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余依次是疏肝高剂量组、补肾高剂量组、补肾中剂量组、疏肝低剂量组和补肾低剂量组。4各组体外培养小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达4.1体外培养不同时间点各组小鼠卵母细胞GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达空白组及正常组：与D2比较，D4、D6GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)。疏肝各剂量组：与D2比较，D4、D6GDF-9蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；BMPRⅡ、ALK5、Smad4蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)；与D2比较，D4、D6Smad2、Smad3蛋白表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。补肾低、中、高剂量组：与D2比较，D4、D6GDF-9蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)。BMPRⅡ、ALK5蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05)。D2、D4、D6Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达有下降趋势，但无统计学意义。4.2各组之间小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达在体外培养的D2、D4、D6：正常组比空白组卵母细胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达均升高(均P＜0.05)。与空白组、正常组比较，疏肝低、中、高剂量组卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P＜0.05)；且疏肝高剂量组蛋白表达最高，其次为疏肝中、低剂量组，呈剂量依赖性。与正常组、空白组比较，补肾低、中、高剂量组的卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达升高(均P＜0.05)；且补肾高剂量组蛋白表达最高，其次为补肾中剂量组和补肾低剂量组，呈剂量依赖性。疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较，补肾高剂量组卵母细胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达高于疏肝高剂量组，其次分别为补肾中剂量组、疏肝中剂量组(P<0.05)，补肾低剂量组与疏肝低剂量组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。各治疗组之间BMPRⅡ蛋白表达的比较，疏肝高剂量组最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各组表达由高至低依次是疏肝中剂量组、补肾高剂量组、补肾中剂量组、疏肝低剂量组和补肾低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。各治疗组之间ALK5蛋白表达比较，补肾高剂量组最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其次依次是补肾中剂量组、疏肝中剂量组、补肾低剂量、疏肝高剂量组、疏肝低剂量组。结论：1逍遥丸和补肾调经方含药血清可提高体外培养小鼠窦前卵泡的存活数，且随着培养时间的延长、卵泡的发育，两方提高卵泡成活数的作用更加显著。2体外培养小鼠卵母细胞D2、D4、D6过程中，GDF-9、BMPRⅡ、ALK5mRNA及蛋白表达呈逐渐下降趋势，提示卵母细胞分泌因子GDF-9及其受体在卵泡发育初期促进卵母细胞发育的作用更加明显。3逍遥丸和补肾调经方对体外培养乳鼠卵母细胞D2、D4、D6过程中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5mRNA及蛋白表达亦呈逐渐下降趋势，但两方均可通过上调体外培养不同时间点小鼠卵母细胞中GDF-9mRNA及其蛋白的表达，提高窦前卵泡的成活率。其机制可能是诱导GDF-9与其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成复合物，进而募集Ⅰ型受体ALK5，然后使其发生磷酸化而活化，活化的ALK5进一步磷酸化细胞内的信号因子Smad2、Smad3、Smad4，进而调控信号转导。两方提高卵泡发育初期卵母细胞质量的作用更为明显。4补肾调经方影响GDF-9信号通路的作用呈剂量依赖性，即高剂量组效果最优。5在体外培养小鼠卵泡过程中，疏肝各剂量组上调GDF-9Ⅱ型受体BMPRⅡmRNA及蛋白表达的作用优于补肾各剂量组，补肾各剂量组上调Ⅰ型受体ALK5mRNA及蛋白表达的作用优于疏肝各剂量组。补肾高剂量组上调Smad2/3/4mRNA及蛋白表达的作用最强。提示补肾法、疏肝法对小鼠体外卵泡发育过程中卵母细胞GDF-9及其信号通路的作用的环节不尽相同，逍遥丸可能主要通过上调GDF-9Ⅱ型受体BMPRⅡmRNA及蛋白表达引起对下游信号分子的变化，进而对卵泡发育发生调控作用，补肾调经方可能主要调控Ⅰ型受体ALK5mRNA及蛋白表达从而调控下游信号分子影响卵泡的发育。6逍遥丸和补肾调经方具有提高卵母细胞质量的作用，尤其是在卵泡发育早期此作用更为显著。
【作者】范丽洁；
【导师】杜惠兰；
【作者基本信息】河北医科大学，中西医结合临床，2014，硕士
【关键词】补肾调经方；逍遥丸；GDF-9；BMPRⅡ；ALK5；Smad2；Smad3；Smad4；

【参考文献】
[1]方菲.开放网络学习环境中的推荐系统研究[D].安徽大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[2]秦耀军.青藏高原五种雀形目鸟类血液气体运输特性的研究[D].兰州大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[3]陈智涛.民办高校招生宣传策略研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[4]李海波.大规模定制策略及在汽车业的应用探索[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[5]王新.基于体裁教学法的大学英语阅读教学模式的实证研究[D].河北师范大学,英语学科教学,2014,硕士.
[6]王倩倩.重要核孔复合体蛋白NUP155相互作用蛋白的筛选[D].华中科技大学,遗传学,2013,硕士.
[7]徐法波.高速网络中检测超点的紧凑算法研究[D].大连海事大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[8]胡小刚.数据挖掘中决策树分类算法的研究[D].华中师范大学,2002.
[9]黄磊.某轿车保险杠内高压成形工艺研究[D].燕山大学,车辆工程,2014,硕士.
[10]吴昊天.基于阴影覆盖的光伏阵列最大功率跟踪研究及实现[D].扬州大学,动力工程（专业学位）,2012,硕士.
[11]刘江,蔡伯根,王剑.地图辅助北斗/惯导组合的列车轨道占用估计方法[J].铁道学报,2014,03:49-58.
[12]严浩.X保障性住房项目风险分析与控制策略研究[D].西南交通大学,项目管理（专业学位）,2014,硕士.
[13]时晓慧.我国慈善法律制度的完善[D].沈阳师范大学,法学理论,2013,硕士.
[14]王凯.体育赛事集群形成机制研究[D].南京体育学院,体育人文社会学,2012,硕士.
[15]张珊珊.罗伯特·威尔逊与南京大屠杀事件研究[D].南京大学,中国近现代史,2013,硕士.
[16]杨江锋.福州地区本科生住院医师规范化培训现状调查研究[D].福建医科大学,社会医学与卫生事业管理,2014,硕士.
[17]杨宝光.承德市人力资源输出管理系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[18]康文军.多线速OTN城域网的业务疏导研究[D].南京邮电大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]王晓琳.基于小波分析的邯郸山区水文特性分析与预测[D].河北工程大学,农业水土工程,2012,硕士.
[20]李国宝.电力市场条件下忻州电网经济运行的研究[D].华北电力大学（河北）,电气工程,2004,硕士.
[21]包更旺.液压高压胶管试验系统关键技术的研究[D].沈阳工业大学,流体机械及工程,2013,硕士.
[22]袁利.宫颈鳞癌及CIN中FOXP3的表达与高危型HPV感染的关系及意义[D].遵义医学院,妇产科学,2013,硕士.
[23]张雅堃.赵汝鐩及其诗歌研究[D].河北师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[24]付杰.基于TDR技术的滑坡监测设计研究[D].长安大学,控制工程（专业学位）,2014,硕士.
[25]王婧.高新技术行业上市公司无形资产与成长性研究[D].安徽大学,会计学,2014,硕士.
[26]宋丽岩.木糖脱水制备糠醛的工艺研究[D].吉林大学,物理化学,2013,硕士.
[27]徐岩.目的语环境下的任务型汉语课外实践活动模式研究[D].沈阳师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[28]彭嘉瑞.甘肃省康乐县乡镇卫生院服务能力分析与评价[D].兰州大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[29]李军农.上市公司经营绩效评价研究[D].武汉大学,2004.
[30]徐丙元.利用微卫星标记定位紫粒小麦的色素基因[D].河北师范大学,细胞生物学,2004,硕士.
[31]隗祎.白癜风患者应激障碍调查及应激障碍调节药物对黑素细胞的影响[D].复旦大学,皮肤病与性病学,2012,博士.
[32]陶兰,杨睿,李四明.WMS:面向领域的Web信息挖掘系统[J].小型微型计算机系统,2004,04:630-633.
[33]夏赞稳.取代1,3-苯并噁嗪的合成及其杀菌活性研究[D].湖南科技大学,化学,2013,硕士.
[34]李强.高密市柴沟镇小城镇建设中的问题与对策研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[35]张红娟.三氧化二砷联合吉西他滨对EL-4细胞作用及其机制研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[36]杜刚.人物类杂志消费文化观念传播与建构的实证分析[D].兰州大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[37]张干.基于力反馈的移动机器人遥操作系统设计与研究[D].东北大学,模式识别与智能控制,2011,硕士.
[38]谢东,张兴,曹仁贤.参数自适应SFS算法多逆变器并网孤岛检测技术[J].电力系统自动化,2014,21:89-95.
[39]丁一冉.燃气吹灰装置参数化设计及其发生器内流场仿真分析[D].河北工业大学,机械工程,2013,硕士.
[40]胡浩民.基于RBF神经网络并行学习模型的数据分类及预测研究[D].上海师范大学,2003.
[41]李泳.集团管控体系下的人力资源管控模式研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[42]刘欣.失能老人正式照料与非正式照料资源整合研究[D].西北大学,社会保障,2014,硕士.
[43]张彬.磁性氧化石墨烯—壳聚糖纳米复合材料固定化的脂肪酶及其应用[D].兰州理工大学,2013.
[44]王瑛.“浊毒”立论的化浊解毒方经JAK/STAT通路对大鼠肝纤维化的作用研究[D].河北医科大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[45]鄂莹晨.企业知识产权网络关系治理研究[D].黑龙江大学,企业管理,2013,硕士.
[46]申主革.中国商业银行个人理财业务的发展研究[D].东北大学,金融学,2010,硕士.
[47]季大奖.煤矿班组安全共享心智模式研究[D].辽宁工程技术大学,企业管理,2012,硕士.
[48]欧阳娟.稀土上转换纳米材料的制备及其性能与细胞成像研究[D].上海大学,应用化学,2014,硕士.
[49]胡仲瑞.输入约束条件下模型预测控制算法研究[D].东北石油大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[50]王亚军.火炮膛内多点压力同步触发测试方法研究[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.