RNAi沉默人唾液腺腺样囊性癌SACC-83细胞bcl-2基因的研究

【摘要】目的:唾液腺腺样囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC）是唾液腺最为常见的恶性肿瘤之一，发生于唾液腺的任何部位。肿瘤恶性程度高，容易沿神经、血管浸润性生长，术后常复发，也可发生肺、骨、脑和肝等远处转移。由于肿瘤的恶性生物学行为，直接威胁患者生命，目前术后尚无有效的治疗方法。B淋巴细胞瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2,bcl-2）基因是一种抑制细胞凋亡的癌基因，在众多凋亡相关基因中bcl-2是目前最受关注的基因之一。定位于人的滤泡性淋巴瘤和正常B淋巴细胞染色体18号21区，含3个外显子和2个内含子，可编码26kD的bcl-2α和22kD的bcl-2β两种蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白。它最先是在人类滤泡型淋巴瘤中发现，被认为是人类滤泡型淋巴瘤的细胞遗传学标志，但后来研究发现，它在人类肿瘤中有广泛意义。在许多肿瘤组织中，bcl-2基因的表达水平通常会发生改变，它与肿瘤的发生、发展及预后有关。RANi（RNAinterference）即RNA干扰，是目前应用较广的一种基因研究技术，是由外源或内源的双链RNA（doublestrandRNA,dsRNA）导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解，从而抑制其相应的基因表达。RNAi具有高特异性、高效性、高稳定性、可遗传性、可扩散性和浓度时间依赖性等特点。利用RNAi技术，在RNA水平特异性抑制特定基因的表达，使特定基因获得功能性丧失，从而成为研究基因功能的良好工具。本实验采用RNA干扰（RNAi）技术特异性沉默人唾液腺腺样囊性癌SACC-83细胞中的bcl-2基因，探讨基因沉默后SACC-83细胞的形态变化及凋亡情况。方法：1重组腺病毒的构建与鉴定：武汉淅玛生物技术公司受本实验室委托，设计并构建重组腺病毒包裹的shRNA-bcl-2，使用双酶切进行鉴定。2细胞培养：采用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液培养人唾液腺腺样囊性癌细胞株SACC-83。3细胞转染及滴度测定：将腺病毒介导的shRNA真核表达载体shRNA-bcl-2（沉默组）和shRNA-HK（阴性对照）转染SACC-83细胞，沉默其bcl-2基因的表达（最佳腺病毒滴度MOI为腺病毒︰细胞=50:1）；未转染shRNA真核载体的SACC-83细胞（未转染组）作为空白对照。4bcl-2基因沉默效率的检测：采用Real-TimePCR技术，从mRNA水平检测基因沉默（RNAi）后SACC-83细胞中bcl-2基因的表达。5细胞凋亡检测：利用流式细胞术分别检测SACC-bcl-2细胞、SACC-HK细胞、SACC-83细胞凋亡情况。结果：1成功构建重组腺病毒包裹的shRNA真核表达载体shRNA-bcl-2.2腺病毒介导的shRNA真核表达载体shRNA-bcl-2转染SACC-83细胞的转染效率为98.18%；shRNA-HK转染SACC-83细胞的转染效率为94.10%。3基因转染48h后，Real-TimePCR时实定量检测发现，腺病毒介导的shRNA-bcl-2对SACC-83细胞中的bcl-2基因mRNA的沉默效率为90.19%。4流式细胞术检测SCCC-83-bcl-2组（沉默组）、SACC-83-HK组（空载体组）、SACC-83组（未转染组），细胞凋亡率分别为8.45±0.25、4.26±0.21和1.48±0.23，沉默组与空载体组和未转染组比较分别具有统计学意义（P＜0.05）。结论：1腺病毒介导的真核表达载体shRNA-bcl-2能够有效的沉默人唾液腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中的bcl-2基因mRNA的表达。2腺病毒介导的真核表达载体shRNA-bcl-2沉默bcl-2基因mRNA的表达后可以诱导SACC-83细胞的凋亡。
【作者】高天艳；
【导师】王洁；
【作者基本信息】河北医科大学，口腔基础医学，2014，硕士
【关键词】唾液腺；腺样囊性癌；bcl-2基因；RNAi；凋亡；

【参考文献】
[1]王焕树.株化集团氯碱生产系统生产管理优化的研究[D].中南大学,工商管理,2004,硕士.
[2]李小波.金融服务业中层管理者职涯资本对职业成功的影响机制研究[D].西南财经大学,人力资源管理,2014,博士.
[3]杨翼鸿.“感动中国”模范宣传对思想政治教育榜样示范法运用的创新及启示[D].西南大学,思想政治教育,2014,硕士.
[4]杜青,包铁成,郭津.加热条件下液体射流不稳定性的高通滤波研究[J].农业机械学报.2006(04)
[5]毛之硕.水粉画新考证与再认识[D].河北师范大学,美术学,2013,硕士.
[6]毕东阳.混合动力客车用复合电源电气架构优化设计[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.
[7]吴肇贵.台湾最大食品集团“统一”的经营战略(下)[J].中外管理.1998(07)
[8]王静文.韩国留学生“是”字句习得情况考察与分析[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[9]李会娜.高中生物教学中生态道德教育素材的挖掘与施教[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[10]张小林.长江流域水土保持生态修复的实践与探索[J].中国水利.2003(13)
[11]伦楠楠.女性艺术中的自我表达与关照[D].西安美术学院,美术学,2014,硕士.
[12]傅晓霞,吴利学.技术差距、创新路径与经济赶超——基于后发国家的内生技术进步模型[J].经济研究,2013,06:19-32.
[13]宋艳霞.基于ZigBee的智能照明设备控制系统设计[D].中北大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[14]张楠.“以人为本”视野下的生态文明建设研究[D].中共陕西省委党校,马克思主义哲学,2014,硕士.
[15]张伟.基于Android平台的体育视频播放技术应用研究[D].北方工业大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[16]孙攀峰.激光飞行打标技术研究[D].天津大学,物理电子学,2004,硕士.
[17]李志勇.富含核黄素营养酵母的研究[D].天津科技大学,发酵工程,2004,硕士.
[18]杨学仁.主冷却剂比活度的计算方法[J].舰船科学技术.1992(05)
[19]叶锦超.新疆乔霍特铜矿区岩浆岩岩石成因与成矿过程[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[20]刘永艳.捆绑和非捆绑特征干扰对ADHD儿童视觉客体工作记忆的影响[D].苏州大学,应用心理学（专业学位）,2014,硕士.
[21]陈文庆,朱伟忠.基于OLEDBforDM的文本分类系统的设计与实现[J].河南师范大学学报(自然科学版),2005,03:141-143+149.
[22]刘荣杰.基于创建国家森林城市的生态文化建设研究[D].中南林业科技大学,林业,2014,硕士.
[23]陈碧芬.高中数学自主学习能力培养研究[D].浙江师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[24]万玲.基于高斯过程的时间序列分类[D].中国矿业大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[25]任密蜂.非高斯系统的控制及滤波方法研究[D].华北电力大学,控制理论与控制工程,2014,博士.
[26]唐晴.帕金森病患者的经颅超声及部分非运动症状的相关研究[D].苏州大学,神经病学（专业学位）,2013,硕士.
[27]姚舟杰.金融危机冲击与中国对美出口贸易变化[D].浙江工商大学,金融学,2013,硕士.
[28]刘灏骏.普拉托诺夫《运动训练分期理论》第十二章（节选）翻译报告[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[29]林律.星形胶质细胞介导的β-淀粉样蛋白降解机制的研究[D].宁波大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[30]姚晶莹.非X态的量子失协[D].苏州大学,光学,2013,硕士.
[31]陈莉.柞蚕热激蛋白90基因的克隆与表达分析[D].安徽农业大学,遗传学,2012,硕士.
[32]程茅薇.数字化医院的研究与实践[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[33]高晗雯.GPON系统ONUMAC层上行链路的研究与实现[D].浙江工业大学,2007.
[34]张美景.以深刻诠释历史以生动打动受众——《南京大屠杀图录》等“二战”系列图书编后感[J].对外大传播,2005,11:39-41.
[35]余正峰.最大输电能力计算及其在华中电网的应用[D].华中科技大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[36]李延军.改革开放以来中国经济周期波动的实证研究[D].河北工业大学,技术经济及管理,2004,硕士.
[37]阳宇.湖南省低碳经济发展的税收制度研究[D].湖南大学,公共管理,2013,硕士.
[38]李阳.文园狮子林与苏州狮子林的对比研究[D].北京林业大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[39]蔡金标,李忠良,楼旦丰,陈双聪,张燕青.基于压电阻抗的混凝土裂缝深度发展定量研究[J].压电与声光,2014,01:79-84.
[40]方艳.数据挖掘在生物信息学中的应用[J].微机发展,2004,04:1-3+17.
[41]马博强.污泥堆肥用于林木及草坪草种植时重金属的迁移与分布研究[D].北京林业大学,环境科学,2013,硕士.
[42]牛宗宾.工业机器人交流伺服驱动系统设计[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[43]张荣.长春市400例儿童维生素D水平及影响因素初步探讨[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[44]柯本喜,郭矛,严昌言,范祯祥.非均匀粘弹介质中有限元地震数字模型[J].石油地球物理勘探,1990,03:245-259.
[45]吴婷艳.大学生网络购物感知风险评价体系研究[D].西安电子科技大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[46]贺殷.产业化过程中衡阳广电冗员裁减的问题与对策[D].湖南大学,工商管理,2003,硕士.
[47]刘衍.β-酮亚胺铝配合物的合成及其催化己内酯、丙交酯的研究[D].燕山大学,化学工程,2014,硕士.
[48]张静.新闻媒体侵害名誉权的法律分析[D].兰州大学,民商法学（专业学位）,2013,硕士.
[49]赵辉.工程造价信息管理web平台的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[50]戈志强.古史传说人物辨析[D].苏州大学,专门史,2003,硕士.