脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞分化过程中的miRNA差异性表达的模式分析

【摘要】目的:本研究课题旨从脂肪间充质干细胞（ADSC）向血管内皮细胞分化的角度入手，通过应用miRNA微列阵及qRT-PCR对分化过程中差异性表达的miRNA进行筛选及证实，从而对这些miRNA的目的基因和所参与的细胞信号通路进行推测与分析。方法:1对hADSC传代、培养，应用ADSC定向血管内皮细胞的诱导培养基进行诱导培养。2对诱导分化前后的ADSC及血管内皮细胞进行流式检测表面抗原标记，应用显微光镜和透射电镜对诱导前后细胞的组织学形态进行观察，比较，以保证试验数据可靠。3对诱导前的ASDCs及诱导后形成的血管内皮细胞进行miRNA的提取，然后对诱导前后细胞的差异性表达miRNA进行miRNA微阵列分析4根据miRNA微列阵的分析结果，选取诱导前后差异性表达倍数较高的miRNA，对其进行qRT-PCR验证，以近一步明确其差异性表达。5应用生物信息学软件David6.7对miRNA微列阵筛查出的差异性表达miRNA进行GO、Pathway分析；6通过使用TargetScan，Miranda，PITA，RNAhybrid，及microTar等五个miRNA数据库，对miRNA微列阵和qRT-PCR分析同时筛查出的差异性表达miRNA进行靶基因预测，选出在三个以上（包括三个）数据库内重复出现的miRNA的预测靶基因，整理成表，以供进一步分析。结果：1流式鉴定：诱导前hADSC细胞CD31、HLA-DR呈阴性表达；CD44、CD105呈阳性表达；诱导后CD44、HLA-DR呈阴性表达，CD31呈阳性表达，CD105呈弱阳性表达。2光镜及透射电镜细胞组织学分析：光镜：细胞诱导前呈长梭形，涡旋状排列；诱导后细胞形态发生明显变化，梭形变短，大部分细胞呈椭圆形。电镜：人脂肪间充质干细胞-诱导前：胞内无W-P小体；人脂肪间充质干细胞-诱导成血管内皮细胞后：胞浆内可见血管内皮细胞特有的电子密度较高的W-P小体，胞浆内可见血管内皮细胞具有的吞饮小泡。3miRNA微阵列分析及qRT-PCR验证：miRNA微列阵：P值〈0.05，30种miRNA在诱导分化前后表达差异性显著：其中16种分化后较分化前表达上调，而14种则表达下调。qRT-PCR：从miRNA微列阵的分析结果中选取6种分化前后差异性表达倍数较高的miRNA，验证出四种显著的差异性表达的miRNA，其中包括分化后较分化前表达上调的has-miR-29b-3p，has-miR-5096；表达下调的has-miR-143-3p，has-miR145-5p。4差异性表达miRNA的靶基因预测及pathway分析：差异性表达miRNA的靶基因所参与的大部分细胞信号途径肿瘤细胞形成的细胞信号通路相关。结论：1ADSC在定向分化为血管内皮细胞的过程中存在差异性表达的miRNA，其差异性表达方式为上调或下调。2ADSC在定向分化为血管内皮细胞的过程中差异性表达miRNA的靶基因所参与细胞信号途径与肿瘤生成参与的细胞信号途径相关。
【作者】朱璟晶；
【导师】周云；
【作者基本信息】苏州大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】脂肪间充质干细胞；定向血管内皮细胞分化；差异性表达miRNA；靶基因；细胞信号通路；

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