经Bcl-2修饰的同种异体骨髓间充质干细胞移植对兔心梗后心功能不全的影响

【摘要】目的：心肌梗死（MI,myocardialinfarction）对人类健康构成严重威胁。MI后心室重构的发生严重影响了MI患者的生活质量。MI后心功能不全已成为患者死亡的主要原因。目前尽管MI的死亡率下降，但MI后心功能不全仍未改善，已成为家庭及社会沉重的负担。心功能不全是各种心脏疾病的终末阶段。药物治疗可以缓解病情，但是无法使受损的心肌细胞再生。要使心肌细胞再生乃至衰竭的心脏恢复功能仍是一项巨大的挑战。干细胞治疗对于逆转终末期损伤心脏是最有希望的治疗方法。间充质干细胞（MSCs,mesenchymalstemcells）存在于多种成体组织内，骨髓是MSCs的主要来源。骨髓间充质干细胞（BMSCs,bonemarrowmesenchymalstemcells）可参与受损心肌的重建，可以提高左室射血分数，降低左心室收缩末期和舒张末期容积、减少梗死面积并改善左室重构。由于MI后微环境的改变使BMSCs在梗死心肌中不能长期存活从而限制了干细胞的修复能力。人们试图通过基因工程的方法来解决这一问题。基因工程是将外源性基因导入目的细胞中，使得该细胞具备过表达或静默表达某种基因的能力。对干细胞加以基因修饰,使干细胞具有更好的促血管再生、抗细胞凋亡、抗炎、修复心功能的作用。外源性基因导入目的细胞中有病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体的转导效率低。目的基因只能实现瞬间表达，容易引发免疫反应和被机体所清除。本实验采用腺病毒转染BMSCs，转染效率高，无毒副作用。Bcl-2是具有明显抑制凋亡作用的基因，以Bcl-2修饰BMSCs可作为提高移植细胞存活率的手段。本研究目的在于观察经Bcl-2修饰的同种异体BMSCs移植对兔心梗后心功能不全模型心功能的影响。方法：制备含目的基因Bcl-2的原始质粒。将目的基因Bcl-2从原始质粒上切下连接到pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体。将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-Bcl-2转移到pAdeno载体上，得到pAdeno-Bcl-2病毒质粒。大量制备重组质粒，共转染293细胞，收集病毒（P1代病毒）。以P1代腺病毒感染293细胞，连续三代反复扩增收集病毒，至P4代行病毒的大量扩增。经反复冻融后保存，于-80℃保存待用。采集3月龄兔胫骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁法培养骨髓间充质干细胞至第九代。用带绿色荧光蛋白标记的空载体腺病毒及带有Bcl-2基因的腺病毒分别转染上述培养细胞。结扎冠状动脉前降支制作心功能不全模型。两周后根据超声心动图结果选取造模成功模型,即左室射血分数(LVEF,leftventricularejectionfraction）≤50％，并随机分为Ad-EGFP-Bcl-2组(n=6)、Ad-EGFP组(n=6)和DMEM组(n=6)。开胸进行细胞移植，Ad-EGFP-Bcl-2组移植Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs、Ad-EGFP组移植Ad-EGFP-BMSCs、DMEM组注入等量DMEM。4周后行心脏超声检查，测量LVEF、左室缩短率(FS,leftventricularfractionalshortening)、左室舒张末内径(LVEDD,leftventricularend-diastolicdiameter)、左室收缩末内径(LVESD,leftventricularendsystolicdiameter)，并用实时荧光定量PCR检测梗死边缘区心肌组织Bcl-2的表达。分析心功能与Bcl-2的表达的相关性。HE染色观察心肌病理改变，荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞的生存。结果：1Ad-Bcl2-GFP腺病毒滴度为2.5×1010PFU/ml；2采用密度梯度离心法和贴壁法成功培养出BMSCs，传至十二代细胞状态仍很好；3本实验采用第九代BMSCs，最佳MOI为500，感染36h后观察到EGFP表达，腺病毒转染率100%；4成功制备兔心梗后心功能不全模型,造模后存活21只，2周后根据心脏彩超结果及造模成功判定标准(LVEF≤50%),共有18只造模成功。5Ad-EGFP-Bcl-2组和Ad-EGFP组与DMEM组相比，心功能改善均优于DMEM组,Ad-EGFP-Bcl-2组改善更明显。EF值[（68.222±3.763）%,(57.056±3.555)%,(47.389±5.567)%,P=0.000],EDD值[（9.556±0.981）mm，(11.611±0.828)mm,(13.389±1.569)mm,P=0.000],ESD值[（5.722±0.647）mm,(7.889±0.544)mm,(9.889±0.749)mm，P=0.000]，FS值[（39.167±3.817）%,(31.833±2.492)%,(25.778±3.851)%，P=0.000]；6心肌梗死边缘区Bcl-2表达在Ad-EGFP-Bcl-2组明显提高（1.015±0.115,0.358±0.057，0.090±0.065，P=0.000）,差异均有统计学意义；7EF与Bcl-2表达呈正相关，相关系数R为0.940，决定系数R2为0.883，回归方程及所有系数均有统计学意义，回归方程为Y=46.664+22.329X；8移植细胞存活率提高了，在荧光显微镜下Ad-EGFP-Bcl-2组BMSCs数目是Ad-EGFP组的1.5倍；9Ad-EGFP-Bcl-2组和Ad-EGFP组与DMEM组相比,病理改变较轻,Ad-EGFP-Bcl-2组效果更好。结论：间充质干细胞易于分离并且大量培养，易于被外源基因转染并稳定表达，同种间无免疫原性。本实验采用腺病毒转染BMSCs，转染效率高，无毒副作用。经Bcl-2修饰的同种异体骨髓间充质干细胞移植可更好地抑制心室重构，改善兔心梗后心功能。其机制可能与抑制凋亡、提高移植后干细胞存活率有关。
【作者】王曼；
【导师】李树仁；
【作者基本信息】河北医科大学，内科学，2014，硕士
【关键词】兔；基因；Bcl-2转染；凋亡；间充质干细胞；心肌梗死；心力衰竭；细胞移植；

【参考文献】
[1]芦小雨.基于Profinet的PCS7在大型锻造控制系统中的应用[J].冶金自动化,2014,03:38-43.
[2]贾颖莲.基于.NET平台的产品数据管理技术的研究与实现[D].浙江工业大学,2005.
[3]高超杰.关于思想政治教育学科界定的理论思考[D].中南大学,马克思主义理论,2014,博士.
[4]牛犇.亚像素边缘检测与几何特征的自动识别[D].合肥工业大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[5]赵维俊,石文江,王荣茂,王洪哲.集控中心建设中不停电进行遥控试验的方法[J].电力系统自动化,2009,10:99-103.
[6]李理,满朝新,刘少敏,李婷,牛婕婷,姜毓君.植物乳杆菌LactobacillusplantarumNDC75017产γ-氨基丁酸的影响因素及其代谢机制的初步探究[J].食品科学.
[7]谢铁金.生死的二极律动[D].湖南师范大学,中国现当代文学,2004,硕士.
[8]于波峰.大功率无刷直流电机控制器的研究[D].南昌航空大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[9]李显旺,张彬,石磊.超级稻联合收获机具的探讨[J].中国农机化.2004(04)
[10]王琼芝.我国高校教师流动的管理机制研究[D].湖南师范大学,教育经济与管理,2004,硕士.
[11]富祯祯.乌龙丹对慢性脑缺血大鼠钟基因及氨基酸类神经递质表达的影响[D].南方医科大学,中药学,2012,硕士.
[12]卢啸,陆新征,叶列平,李梦珂.适用于超高层建筑的改进地震动强度指标[J].建筑结构学报,2014,02:15-21.
[13]张金鑫,王逸.会计稳健性与公司融资约束——基于两类稳健性视角的研究[J].会计研究,2013,09:44-50+96.
[14]康群招.抵党胶囊的制备工艺及质量标准研究[D].广州中医药大学,药剂学,2013,硕士.
[15]刘斌.基于公共危机视角的高速铁路运营安全机制研究[D].天津商业大学,行政管理,2013,硕士.
[16]严自力.杜邦分析法在汽轮机行业成长性中的应用[J].中国科技信息,2005,16:163-161.
[17]杨雅婷.慈善募捐危机应对及立法研究[D].四川省社会科学院,法律（专业学位）,2014,硕士.
[18]胡蓉.喘可治注射液联合化疗治疗老年非小细胞肺癌的临床研究[D].广州中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[19]程飞,王海平,叶誉贤,梁静静,徐立新.HBPE-b-PMMA嵌段共聚物的合成及其在甲苯中非共价剥离石墨制备石墨烯溶液的研究[J].高分子学报,2014,07:1002-1009.
[20]赵勇.隧道软弱围岩变形机制与控制技术研究[D].北京交通大学,2012.
[21]薛俊锋.稀疏矩阵的恢复[D].湖北大学,应用数学,2011,硕士.
[22]关怀.材料耦元对激光仿生耦合处理材料拉伸性能的影响[D].吉林大学,材料工程,2014,硕士.
[23]郭章宝.线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作的临床分析[D].华中科技大学,神经病学,2013,硕士.
[24]樊丽伟.Pokemon、TIP30在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[25]张晶.扬州市科技创新能力评价与提升研究[D].扬州大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[26]韩冬.基于博弈论的建筑业农民工工伤保险问题研究[D].天津财经大学,社会保障,2012,硕士.
[27]沙锡鉴.荆丘构造的地震地质解释[J].石油地球物理勘探,1984,06:519-529.
[28]吴修德.基于工业以太网的车间数字设备集成控制的关键技术研究[D].武汉理工大学,2007.
[29]王申.基于内容的垃圾邮件过滤技术的若干研究[D].中国科学院研究生院（计算技术研究所）,2005.
[30]罗杰.独立学院转设后的发展研究[D].中国地质大学（北京）,高等教育学,2014,硕士.
[31]邬娟.高维耦合趋化—流体模型解的全局存在性[D].吉林大学,应用数学,2013,硕士.
[32]周彬.锦标赛理论在股权激励行权设计中的应用研究[D].厦门大学,会计学,2014,硕士.
[33]安泽鑫.脑梗死后磁共振T_1WI高信号的相关因素分析[D].大连医科大学,神经病学,2012,硕士.
[34]丁丙.直馈包围多级放大级的设计——宽频带运算放大器[J].自动化学报,1965,04:205-211.
[35]裴忠民,邓志东,徐硕,许潇.一种基于N-最优阶次序列的无线传感器网络节点定位方法[J].自动化学报,2010,02:199-207.
[36]郑海英,刘正阳,冯卫东.并购商誉能提升公司业绩吗?——来自A股上市公司的经验证据[J].会计研究,2014,03:11-17+95.
[37]赵卓宽.信任的经济学分析[D].辽宁大学,西方经济学,2012,硕士.
[38]谭晶晶.湖北省六所高校硕士研究生体育生活方式与影响因素的研究[D].华中师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[39]胡浪.税收不公的成因与法律对策研究[D].华中师范大学,法律,2013,硕士.
[40]鲁金明.大孔载体上制备NaA分子筛膜的研究[D].大连理工大学,化工工艺,2004,硕士.
[41]石菲菲.农村初中辍学学生教育价值取向调查研究[D].西南大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[42]刘杰,方勇,李哲,高一军.基于主机的入侵检测系统分析[J].信息网络安全,2002,09:30-31.
[43]游俊刚.四川省电力公司在新形势下的营销战略及策略初探[D].西南财经大学,工商管理,2004,硕士.
[44]陈啸.铁电陶瓷氧化物相变的光谱学研究及物性测试系统[D].华东师范大学,微电子学与固体电子学,2014,博士.
[45]田雷雷,魏贤勇,庄全超,宗志敏,孙世刚.石墨烯包裹Cu_(2+1)O/Cu复合材料的制备及其储锂性能[J].化学学报,2013,09:1270-1274.
[46]孔祥金,曹振海,刘楚学.艉斜浪中舰船稳性研究[J].舰船科学技术.1993(05)
[47]敏世雄,吕功煊.CdS/石墨烯复合材料的制备及其可见光催化分解水产氢性能[J].物理化学学报,2011,09:2178-2184.
[48]赵建国.汪曾祺小说创作观研究[D].扬州大学,文艺学,2011,硕士.
[49]张锳.同步发电机阻尼特性分析与励磁优化控制研究[D].华中科技大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[50]魏拉义.BiFeO_3/NiZnCu复合材料的制备和性能研究[D].东北大学,材料学,2011,硕士.