microRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用及机制研究

【摘要】生物体衰老是一个包含不同器官和系统的、发生一系列特定变化的复杂过程。皮肤衰老是机体衰老最直接的表现,本质和基础是皮肤细胞的衰老,其不仅受控于遗传基因的调节,也受控于表观遗传的调控,后者是衰老发生的重要机制,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及microRNA(miRNA)调控等。miRNA-217是一种已知高表达于人脐静脉内皮细胞及人冠状动脉内皮细胞中的miRNA,已被证实其在胰腺导管腺癌中能通过靶向调控KRAS起到肿瘤抑制因子的作用,还可靶向调节Runx2,从而影响成骨细胞成熟。在衰老机制的研究中,已有报道显示,miR-217在衰老的血管内皮细胞中表达上调,并可通过抑制长寿基因Sirt1的表达导致血管内皮细胞的衰老。然而,至目前为止,miR-217对于皮肤衰老的作用研究还不清楚。本课题组前期通过miRNA芯片发现传代衰老组与年青组人皮肤成纤维细胞(Humanskinfibroblasts,HSF)比较,miR-217的表达量明显增加。因此,我们推测miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。本研究通过三个部分证实miR-217在HSF衰老中的作用机制。第一部分：检测比较年青组与衰老组HSF中miR-217的表达。第二部分：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。通过在年青组HSF中过表达miR-217并检测细胞衰老的表型及相关衰老蛋白的表达,以探讨miR-217在细胞衰老中的作用。第三部分：研究miR-217调控HSF衰老的机制：(1)通过生物信息学预测,发现miR-217可能直接靶向DNA甲基化转移酶1(DNMT1),利用双荧光素酶报告基因系统证明两者的直接靶向关系；(2)在HSF中,检测miR-217对DNMT1表达量的调节,及其通过DNMT1对细胞衰老调节的机制。通过以上研究揭示miR-217能够通过下调DNMT1来促进HSF的衰老,为皮肤衰老的研究和治疗领域提供新的方向。第一部分年青组与衰老组人皮肤成纤维细胞中miR-217的表达目的：检测自然衰老与传代衰老HSF中miR-217的表达水平。方法：收取少年组(<10岁)、中年组(30～50岁)与老年组(>60岁)的正常人避光部位皮肤,原代培养HSF,并将少年组HSF进行传代(年青组：P3-5,衰老组：P20-25),采用Real-timePCR方法检测miR-217的表达量。结果：和少年组细胞比较,中年组、老年组HSF中的miR-217表达量明显升高(中年组：P<0.05,老年组：P<0.01),其中老年组较中年组细胞中miR-217的表达量也显著升高(P<0.01)。和年青组细胞比较,传代衰老组细胞的miR-217的表达量亦明显升高(P<0.01)。结论：自然衰老与传代衰老的HSF中miR-217的表达明显上升。第二部分miRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。方法：在年青组HSF中,通过稳定转染hsa-miR-217的慢病毒和阴性对照慢病毒,48小时后,采用Real-timePCR方法检测miR-217的表达量,MTT法检测HSF细胞增殖能力,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率,westernblot法检测衰老相关蛋白P53、P21、sirt1等的改变。结果：转染hsa-miR-217的慢病毒后,HSF中的miR-217表达量显著上调(P<0.01),细胞增殖能力明显下调(P<0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P<0.01),衰老相关蛋白P53、P21的表达量上升、sirt1表达量下降(P<0.05)。结论：过表达miR-217可明显促进HSF的衰老,miR-217在HSF的衰老过程中起到重要作用。第三部分miRNA-217直接调控HSF中DNMT1的表达及机制目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的调控机制。方法：通过MICRORNA.ORG网站预测DNMT1是否为hsa-miR-217可能的直接靶向基因,并构建DNMT1的3’UTR区域的野生型与突变型的荧光素酶报告基因质粒,在293T细胞中,分别转染野生型与突变性DNMT1-3’UTR质粒,4小时后将miR-217化学模拟物(mimics)转染细胞,48小时后溶解细胞,荧光素酶检测系统分析荧光强度。构建含DNMT1shRNA序列的慢病毒载体,通过在年青组HSF中抑制DNMT1的表达量来检测HSF的衰老表型。利用第二部分中稳定转染的年青组HSF,提取细胞总蛋白,利用westernblot法检测DNMT1的蛋白表达量,并在过表达miR-217的年青组HSF中,转染DNMT1-cDNA质粒,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率。结果：MICRORNA.ORG网站预测到miR-217的3’UTR区域可以直接靶向DNMT1的序列。荧光素酶报告基因检测显示,野生型的DNMT1-3’UTR质粒转染后,过表达miR-217后,荧光量较未过表达组下降(P<0.05),而突变型的DNMT1-3’UTR转染组未发生明显变化。年青组HSF中抑制DNMT1的表达量后,细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P<0.01)；年青组HSF中过表达miR-217后,DNMT1的蛋白表达量明显下降(P<0.01)；同时转染含hsa-miR-217shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒载体后,较单独下调hsa-miR-217组,衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P<0.05)。结论：DNMT1是miR-217的调控的靶基因,miR-217可直接靶向结合DNMT1的3’UTR区；传代衰老的HSF中DNMT1表达量明显下降,抑制DNMT1的表达量后,可以明显促进HSF的衰老；miR-217通过抑制DNMT1的表达量从而促进HSF的衰老。
【作者】汪犇；
【导师】谢红付；李吉；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】自然衰老；传代衰老；HSF；miR-217；衰老表型；DNMT1；荧光素酶报告基因；衰老；

【参考文献】
[1]严留俊,张艳芳,陶文沂,王利平,吴胜芳.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法快速测定酱油中的挥发性风味成分[J].色谱,2008,03:285-291.
[2]张巧丽,刘德伟.文科大学物理课程教学改革探索[J].中国电力教育,2014,02:154-155.
[3]刘进财.功能性大尺寸富勒烯C_(106)的理论研究[D].哈尔滨工业大学,物理化学,2014,硕士.
[4]俞涛,李睿,顾海晨,范宏海.系统安全的忠实卫士:InfoRobot[J].信息网络安全,2001,08:38-40.
[5]郜春海.基于通信的轨道交通列车运行控制系统[J].现代城市轨道交通,2007,02:7-10+74.
[6]孙鹏龙.前驱型CVT混合动力汽车再生制动控制策略[D].河南科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[7]黄文育.石墨烯可饱和吸收的掺铒光纤锁模激光的研究[D].山东大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[8]王凯润.大发供热公司营销系统整合项目规划管理研究[D].吉林大学,工业工程,2013,硕士.
[9]关玉申.东元发展公司职工内部持股动作与管理[D].大连理工大学,管理科学与工程,2003,硕士.
[10]彭程.国有大型工程勘察设计单位“改企建制”框架设计[D].华北电力大学（北京）,技术经济及管理,2004,硕士.
[11]金秋娴.重庆泰康保险公司薪酬体系优化设计研究[D].西南大学,企业管理,2014,硕士.
[12]梁贞爱.汉韩动宾结构对比研究——以汉语“吃”和韩国语“■”对比为例[J].云南师范大学学报(对外汉语教学与研究版),2014,02:70-76.
[13]朱玉梅.网络环境下教学模式的研究[D].山东师范大学,2003.
[14]刘磊.造型意义上的形式问题[D].吉林大学,美术,2013,硕士.
[15]李亚飞.我国学术著作出版赢利机制研究[D].华中师范大学,传播学,2014,硕士.
[16]蒋文龙.基于DPI技术的P2P流量监控系统的研究与设计[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[17]汪静华.浅论民俗视角教学在《红楼梦》选文教学中的意义[D].华东师范大学,学科教学,2012,硕士.
[18]张世涛.混凝土结构水泥基（MOC）无机胶植筋试验研究[D].山东建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]史鸿鑫,王正轩,武宏科,项菊萍,陈立军,沈海民.含全氟壬烯基丙烯酸酯单体合成及乳液聚合[J].精细化工,2013,07:789-792+824.
[20]郭亮.磷酸盐作用下红壤对重金属Cu、Zn吸附以及迁移转化的研究[D].湖南大学,环境工程,2014,硕士.
[21]郝兴阁.稀硝酸作吸收剂的气态膜法脱除、回收废水中氨氮的研究[D].天津大学,生物化工,2013,硕士.
[22]苏守宝.基于遗传算法的聚类挖掘研究[D].安徽大学,计算机及应用,2004,硕士.
[23]郭立平.热连轧变形抗力模型的优化改进[J].冶金自动化,2012,02:70-72.
[24]田创,潘淑媛,李雄飞,羊巧莉,傅韩承.大学生网络创业模式与支持体系理论研究[J].现代物业(中旬刊),2013,07:76-79.
[25]张健平.我国集体土地用益物权抵押制度研究[D].安徽大学,法律,2013,硕士.
[26]韩大娜.我国社区矫正制度的现状与反思[D].郑州大学,诉讼法学,2013,硕士.
[27]李向强.中三角旅游经济发展差异与一体化战略研究[D].华中师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[28]黄琴.对我国著名教练员阮元华训练模式的研究[D].天津体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[29]王明轩.某燃煤电厂300MW机组SCR烟气脱硝装置结构优化和应用研究[D].哈尔滨工业大学,环境科学与工程,2014,硕士.
[30]王志立.北宋官僚权力制约机制研究[D].郑州大学,专门史,2014,博士.
[31]张军英,许进,保铮.稳健二进神经网络及其基本性质研究[J].自动化学报,2001,05:657-664.
[32]周平.Allo-HSCT移植后EB病毒重激活及移植后淋巴细胞增殖性疾病的临床分析[D].苏州大学,儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[33]钟晓鸣.运用商业智能,提高零售企业竞争力[J].商场现代化,2005,24:42-43.
[34]高丽.铌在钢中的结构及铌对钢性能影响的第一性原理计算[D].内蒙古科技大学,机械工程,2013,硕士.
[35]冯刚,林克伟,王华峰,张朝阁,孟爱英.注塑成型可视化技术的最新研究进展及前景预测[J].塑料工业,2014,12:9-12+33.
[36]丁瑜.中国市场上定向增发中机构投资的角色和利益输送研究[D].中国科学技术大学,金融工程,2014,硕士.
[37]杜阳.基于有机硅溶胶制备LDPE/SiO_x纳米复合材料的研究[D].哈尔滨理工大学,高分子化学与物理,2012,硕士.
[38]卫丽.金融信息系统开发的风险管理[D].对外经济贸易大学,产业经济学,2004,硕士.
[39]钱钱.米切姆技术哲学思想初探[D].大连理工大学,科学技术哲学,2004,硕士.
[40]茅明辉.利用数据仓库技术实现电信业务经营分析[D].南京理工大学,2004.
[41]朱凤民.槐糖脂在饱和CO_2油田采出水中对X65钢的缓蚀行为研究[D].中国海洋大学,分析化学,2014,硕士.
[42]孙凌云.孙颖立教授治疗原发免疫性血小板减少症的经验总结与分析[D].北京中医药大学,内科学,2014,硕士.
[43]祁菲菲.真实盈余管理的短视后果研究[D].华侨大学,会计学,2013,硕士.
[44]张芸.临沧市特色农业发展问题研究[D].华中科技大学,行政管理,2013,硕士.
[45]李杰,韦庆,常文森.机器人控制器中应用加速度反馈的几个问题讨论[J].自动化学报,2001,03:318-325.
[46]赵德源.SC公司市场营销战略与实施策略研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[47]白丽娟.纳米及生物放大技术构建信号增强型电化学适体传感器的研究[D].西南大学,2014.
[48]邓丰,曾祥君,陈楠,李泽文,李立彬.自适应网络结构的故障行波定位方法[J].电力系统自动化,2009,19:66-70.
[49]夏南.不同氨氯地平对SHR大鼠血压、肾脏的影响[D].华中科技大学,内科学,2013,硕士.
[50]王贺.CO_2对Ba_(1.0)Co_(0.7)Fe_(0.2)Nb_(0.1)O_(3-δ)混合导体透氧膜的腐蚀行为研究[D].上海大学,材料加工工程,2014,硕士.