海马Racl活性与场景恐惧记忆的维持及遗忘

【摘要】目的：研究海马Racl活性与场景恐惧记忆保持及遗忘的关系,探讨PTSD病理性恐惧记忆不能遗忘的分子机制,为PTSD患者的治疗提供新的理论指导。方法：实验一：确定一个能诱导出相似学习曲线,但产生不同恐惧记忆的实验方案。成年健康雄性SD大鼠在条件恐惧操作箱内接受5次电击强度为0.5、0.8或1.2mA的足底电击,两次电击间隔时间为12s、122s或600s,24h后进行恐惧记忆的检测。实验二：探讨0.8mA电击强度学习后不同时间点产生的恐惧记忆及其与海马Racl活性的关系。动物在条件恐惧操作箱内接受5次电击强度为0.8mA的足底电击,两次电击间隔时间为12s,122s或600s,1h、24h或7d后进行恐惧记忆的检测,部分大鼠电击结束后取材用于Rac-GTP的westernblotting(WB)检测及免疫组织化学(IF)染色。实验三：探讨Racl的活性是否调节着大鼠的场景恐惧记忆。成年雄性SD大鼠在条件恐惧操作箱内接受5次足底电击,两次电击问隔时间为12s或122s,12s组大鼠电击结束后立即双侧海马CAl区予Racl抑制剂NSC23677,122s组大鼠双侧海马CA1区予Racl激动剂CN04-A后行足底电击,24h和(或)7天后进行恐惧记忆的检测。实验四：探讨场景恐惧记忆的消退与海马Racl活性的关系。成年雄性SD大鼠在条件恐惧操作箱内接受5次足底电击,24h后在条件恐惧操作箱内接受6次每次5min的消退训练,两次消退训练间隔时间为0min,10min或30min,消退结束后24h和16d进行恐惧消退的检测。部分大鼠消退结束后1h取材用于WB或IF。实验五：探讨Racl活性是否直接调节场景恐惧记忆的消退。成年雄性SD大鼠在条件恐惧操作箱内接受5次足底电击,24h后在条件恐惧操作箱内接受6次每次5min消退训练,两次消退训练无间隔,消退训练结束后立即双侧海马CA1区予Racl抑制剂NSC23677,24h和16d后进行恐惧记忆的检测。实验六：进一步探讨Racl活性是否调节着场景恐惧记忆的消退。成年雄性SD大鼠在条件恐惧操作箱内接受5次足底电击,24h后接受6次每次10min的强消退训练,两次消退训练间隔时间为0min,10min或30min,消退结束后24h和16d进行恐惧记忆的检测；部分大鼠消退结束后1h取材用于WB或IF。结果：实验一：0.5mA电击强度学习后,三组大鼠(12s,122s和600s)24小时恐惧记忆检测无明显差异,0.8mA或1.2mA电击强度学习后,122s和600s组大鼠表现为场景恐惧记忆增强,与12s组比具有统计学差异,此结果显示0.8mA符合我们的实验要求。实验二：学习后1小时恐惧记忆检测结果显示122s和600s组大鼠恐惧记忆明显强于12s组,具有统计学差异；24h、7d恐惧记忆检测结果类似1h,122s和600s组大鼠恐惧记忆显著强于12s组。Westernblot检测结果显示条件恐惧学习后0h时间点三组大鼠海马Rac1-GTP的表达与正常对照大鼠相似；1h时间点间隔学习组(122s和600s组)大鼠海马Rac1-GTP的表达显著下调,其中122s组低于600s组,集中学习组(12s)Rac1-GTP的表达类似正常组；24h时间点间隔学习组(122s和600s组)大鼠海马Rac1-GTP的表达仍下调,但与正常对照相比未达统计学差异,集中学习组Rac1-GTP的表达类似正常组。免疫荧光染色结果显示正常大鼠Rac1-GTP的染色主要分布于神经元的胞膜和突起,可见Rac1-GTP阳性的胶质细胞及中间神经元。集中学习组海马CA1区Rac1-GTP的染色类似正常组,间隔学习组(122s和600s组)CA1区神经元Rac1-GTP染色明显减弱。此结果显示间隔学习诱发海马Racl活性下调及强的场景恐惧记忆。实验三：24h恐惧记忆检测结果显示予Racl抑制剂(12s+NSC)组大鼠恐惧记忆明显强于予生理盐水(12s+sal)组,达到122s组水平,差异具有显著性,7d再次检测结果类似24h。恐惧学习后7d第一次行恐惧记忆检测的结果同样显示Racl抑制剂(12s+NSC)组大鼠恐惧记忆明显高于生理盐水对照(12s+sal)组,达统计学差异；Racl激动剂CN04-A(122s+CN04-A)组大鼠24h恐惧记忆检测显著低于生理盐水对照组(122s+sal),7d再次检测结果类似24h。此结果显示调节海马Racl活性可调节大鼠场景恐惧记忆的强弱。实验四：结果显示0min组(集中消退)恐惧消退训练时成绩明显优于10min和30min组(间隔消退),消退训练后24h检测结果显示三组大鼠(0min、10min、30min)恐惧记忆均出现明显消退,组间无差异；消退后16d再次检测结果显示0min组大鼠恐惧记忆进一步降低,10min组部分恢复,30min组几乎完全恢复,三组间达统计学差异。WB检测结果显示0min组大鼠海马Racl-GTP表达显著上调,30mmin组轻度下调；免疫荧光染色结果显示0min组大鼠海马CA1区Rac1-GTP染色增强,30min组染色减弱。此结果显示集中消退促进大鼠海马Racl的激活及明显的场景恐惧记忆消退。实验五：24h恐惧消退结果显示Racl抑制剂(0min+NSC)组大鼠恐惧记忆高于生理盐水组(0min+sal),但未达统计学差异,16d再次检测结果显示Racl抑制剂(0min+NSC)组大鼠恐惧记忆明显高于生理盐水(0min+sal)组,两组间具有统计学差异。此结果显示抑制海马Racl的激活清楚了集中消退诱发的场景恐惧记忆较弱效应。实验六：结果显示0min组(集中消退)大鼠消退训练时消退成绩明显优于10min和30min组(间隔消退),消退训练后24h检测结果显示三组大鼠(0min、10min、30min)恐惧记忆均出现明显消退,其中10min组略高于0min组和30min组,但组问无统计学差异；消退后16d检测结果显示三组大鼠的恐惧记忆均出现明显消退。WB检测结果显示与正常对照组相比,0min和10min组大鼠海马Racl-GTP的表达均上调,其中0min组达统计学差异。免疫荧光染色显示0min和10min组大鼠海马CA1区Racl-GTP染色均增强,30min组染色与正常对照组相似。此结果显示促进海马Racl活性的恢复促进了场景恐惧记忆的消退。结论：抑制海马Racl活性导致大鼠场景恐惧记忆增强及场景恐惧记忆消退受损,激活海马Racl致使大鼠场景恐惧记忆减弱及场景恐惧记忆消退增加,海马Racl活性水平调节着场景条件恐惧学习大鼠场景恐惧记忆的强弱及场景恐惧记忆的消退效果。Racl活性调节着果蝇记忆的遗忘,因此,我们提出海马Racl的活性调节着大鼠场景恐惧记忆的维持与遗忘,本研究提示PTSD患者病理性恐惧记忆增强可能与其海马Racl不能正常激活,导致恐惧记忆的遗忘受损有关。
【作者】蒋丽珠；
【导师】李凌江；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】创伤后应激障碍；海马；Rac1活性；遗忘；场景恐惧记忆；

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