磁共振量化评价移植干细胞与受体心肌相互作用的实验研究

【摘要】目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有多向分化潜能,是急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)后干细胞移植治疗的理想供体。既往临床试验证实MSCs移植可以改善心梗后心功能,减缓心室重塑。但是,干细胞移植后的转归及其作用机制尚不明确,而这些资料难以从临床研究中获得,需要借助于心肌梗死(简称心梗)的动物模型。目前通过结扎冠状动脉前降支造成左室前壁急性心梗的大鼠心梗模型已经广泛应用于干细胞移植实验中,选择合适的心功能测量方法及干细胞示踪方法对于干细胞移植疗效评估及机制研究具有重要意义。磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)空间分辨率高,能够清晰显示心脏的解剖结构及准确评价心脏整体及局部的功能变化,可重复性高,已成为国际上干细胞移植临床试验的首选心血管成像方式。然而成年大鼠心率为370-580次/分,呼吸频率为60-120次/分,其心脏检查的MRI设备要求比临床常规设备具有更高的时间、空间分辨率。如何将广泛应用于临床试验的无创影像学方法移植到大鼠模型,仍是一项极富挑战性的工作。因此本研究第一部分旨在探讨超高场强(7.0T)小动物磁共振评价大鼠心梗模型心功能及活体示踪移植后MSCs的可行性。方法：分离并培养雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠骨髓MSCs,移植前行微米级氧化铁颗粒(micron-sizedparticlesofironoxide,MPIO)和DM-DiI双重标记；通过开胸直视下结扎SD雌性大鼠冠状动脉前降支制作AMI模型,分别于术前及术后1周行MRI扫描测量心功能各参数,包括左室射血分数(leftventricularejectionfraction,LVEF)、左室舒张末容积(enddiastolicvolume,EDV)、左室收缩末容积(endsystolicvolume,ESV)及左室心肌质量(1eftventricularmass,LVM)。随后再次开胸于梗死周边区心肌内注射2×106浓度的MSCs,3天后行MRI扫描,扫描结束后取材行病理组织学检测。结果：心脏MRI电影成像结果显示,心梗区主要位于左室前壁,可见受累心肌室壁变薄,收缩运动明显减弱或消失,LVEF较术前显著降低(52.45±7.32%vs.65.84±8.34%,P<0.001),而EDV和ESV显著增加(2.71±0.58mlvs.2.52±0.42ml,P<0.05；1.31±0.15mlvs.0.86±0.13ml,P<0.05)。MSCs移植后3天行心脏MRI成像结果显示,电影序列和T2*加权序列均可于注射点心肌内检测到明显的低信号区,其中T2*加权图像显示该低信号区的边界更清晰。病理组织学结果显示梗死区域室壁变薄,纤维组织增生,心肌细胞被分割成岛状(HE染色和Masson’s染色)；而于注射点区可见普鲁士蓝铁染色阳性细胞群,同时荧光显微镜下亦可观察到双重荧光标记的阳性细胞,提示MRI图像上的低信号区对应的正是移植MSCs。结论：7.0T磁共振电影成像序列可以用于大鼠心梗模型心功能的评估；借助细胞内对比剂MPIO,磁共振T2*加权序列可以活体示踪移植入心肌的MSCs。目的：利用7.0T小动物专用磁共振成像仪(rnagneticresonanceimaging,MRI),借助超顺磁性氧化铁颗粒活体动态示踪移植治疗大鼠心肌梗死(心梗)的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),以期明确MRI在体示踪信号与移植细胞的量效关系,评价MRI远期示踪的可靠性；同时动态评估干细胞移植治疗心梗的疗效,并以病理组织学及分子生物学实验为佐证,探讨干细胞治疗心梗的可能干预机制及其转归。方法：分离并培养雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠MSCs,移植前行微米级氧化铁颗粒(micron-sizedparticlesofironoxide,MPIO)和DM-DiI双重标记。通过开胸直视下结扎SD雌性大鼠冠状动脉前降支制作急性心梗模型,心梗1周后行MRI检测排除不合格心梗大鼠,将合格心梗大鼠随机分为2组,分别接受梗死周边区心肌内注射MSCs2×106/50μl(MSCs组)或磷酸盐缓冲液(PBS)50pl(对照组)。然后分别于移植后3天、2周及4周行MRI扫描,活体动态量化评估移植细胞的信号改变并测量各个时间点心功能的变化情况。在每个时间点MRI扫描结束后每组各取材5-8只大鼠行病理组织学及分子生物学检测。结果：MSCs组中有3只动物未被探及明显低信号区,其余动物均可检测到边界清晰的T2*低信号区。直到第4周,各只动物的注射点T2*低信号区仍可以探及,但随着时间的延续该低信号区面积及信号对比度均逐渐减小。其中,MSCs移植后4周的注射点T2*低信号区的对比度(%)及面积(mm2)与移植后3天相比均有显著性差异(95.27±20.10%vs.62.14±13.58%,P<0.05；5.34±0.80mm2vs.2.53±0.93mm2,P<0.05)；对照组则始终未探测到低信号区。MRI心功能分析结果显示,心梗后1周两组均可观察到梗死区心肌运动减弱,出现局部运动失常、室壁变薄和左室腔扩张,EDV、ESV增大而LVEF降低。随着时间的延续,对照组心梗大鼠的心功能不断恶化,而MSCs移植组则有不同程度的改善。到第4周,对照组LVEF值下降达20%(41±5%vs.baseline52±7%,P<0.05),明显低于MSCs移植组(49±6%vs.51±6%,P<0.05)；对照组EDV及ESV也显著大于MSCs组(4.8±0.4tmlvs.3.6±0.4ml,P<0.05;2.8±0.3mlvs.1.8±0.4ml,P<0.05);对照组相对心梗面积也显著高于MSCs组(18±2%vs.14±2%,P<0.05)。组织学检测结果显示,与对照组相比,MSCs组梗死周边区细胞凋亡(TUNEL染色)及纤维化(Masson’s染色)减少,血管分布数量(CD31染色)增多。将第4周MRI对应有低信号区的心肌切片行普鲁士蓝铁染色及CD68染色,结果发现,铁染色阳性的区域几乎同样为CD68染色阳性区域,提示4周后移植的干细胞几乎全部被心肌巨噬细胞吞噬,而MRI所探测到的低信号区是由被巨噬细胞吞噬后的MPIO所导致的。RT-PCR结果显示4周后受体心肌SRY基因的表达量极低,进一步证实干细胞存活率极低。结论：MSCs移植后4周几乎完全被心肌巨噬细胞吞噬,MRI上探测到的低信号区为假阳性,提示铁颗粒并不能远期有效示踪MSCs；尽管MSCs移植后4周的存活率极低,仍可一定程度地改善心功能、延缓心室重构,原因可能与MSCs的旁分泌作用有关,包括抑制心肌纤维化、减少细胞凋亡及增加心梗周边区血管生成。
【作者】陈秀玉；
【导师】赵世华；
【作者基本信息】北京协和医学院，影像医学与核医学，2014，博士
【关键词】磁共振成像；大鼠；心肌梗死；骨髓间充质干细胞；氧化铁颗粒；

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