芘胁迫对马氏珠母贝抗氧化酶和芳香烃受体相关基因表达的影响

【摘要】多环芳烃(PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs)作为典型的持久性有机污染物广泛存在海洋环境中,大多数多环芳烃具有致畸、致癌、致突变毒性,对环境生物甚至人类危害较大。随着海洋多环芳烃污染的日益加剧,其对海洋生物的毒性研究已成为热点问题。芘(Pyrene)作为典型的四环类多环芳烃,在海洋环境以及生物中的含量较高,并具有遗传毒性和致癌性。截至目前,芘对海洋生物毒性机制,尤其是分子基因水平的研究还很少。本文以近海养殖经济珍珠贝类马氏珠母贝Pinctadamartensii为研究对象,克隆了马氏珠母贝芳香烃受体通道相关基因,包括芳烃受体蛋白基因(arylhydrocarbonreceptor,ahr)、混合功能氧化酶中的(cytochromep450,cyp4)以及热休克蛋白90(heatshockprotein90,hsp90),研究了芘(Pyrene)胁迫对马氏珠母贝的亚慢性毒性效应(抗氧化防御系统、基因的差异表达),探讨双壳贝类对芘胁迫的代谢机制,为海洋环境多环芳烃污染提供早期预警,为PAHs生态风险评估提供科学研究基础。研究结果如下：1、芘胁迫对马氏珠母贝不同组织的抗氧化酶有明显影响。三种抗氧化酶在不同组织和不同胁迫时间的敏感性有所差异：芘胁迫对马氏珠母贝鳃组织中(Superoxidedismutase,SOD)、(Peroxidase,POD)、(Glutathioneperoxidase,GPx)三种酶活性影响主要表现为诱导现象,其中SOD和GPx的活性在胁迫第7d和第10d均表现出明显的剂效关系,而POD活性在第7d有明显剂效关系,第10d变化不明显；芘胁迫对肝胰腺三种酶活性的影响随时间的变化主要表现为先抑制后诱导的作用,且在染毒第10d,三种酶活性表现出一定的剂效关系。2、采用(RapidamplicationofcDNAends,RACE)方法首次克隆了马氏珠母贝芳烃受体(ahr)介导的关键基因(ahr、cyp4、hsp90),相关基因的表达具有组织差异性：马氏珠母贝ahrcDNA全长4253bp,开放阅读框(Openreadingframe,ORF)为2547bp,共编码848aa,具有2个核定位序列(Nucleotidelocalizationsequence,NLS)K14RRRR18,P35SKRHRE41.ClustalW分析显示,马氏珠母贝ahr氨基酸序列与其它物种的ahr序列具有很高的相似性。RT-PCR结果显示在马氏珠母贝的鳃、消化盲囊、外套膜中均有表达,闭壳肌、性腺、腹足中表达较低,鳃组织中表达量最高。cyp4基因cDNA全长包含1855bp,开放阅读框编码498个氨基酸,cyp4半胱氨酸血铁红素签名序列(F438SAGPRNCIG447)中血红素铁结合位点cys445高度保守,多重序列比对表明马氏珠母贝cyp4序列与其他软体动物相似度较高,其中与栉孔扇贝ChlamysFarreri相似度最高为50.2%。RT-PCR显示马氏珠母贝cyp4在鳃组织中表达量最高,其次是外套膜和肝胰腺,在其它组织中也有较高的表达。hsp90基因cDNA全长为2584bp,开放阅读框包含2178bp,编码725aa。氨基酸序列与其他物种的hsp90氨基酸序列具有很高的相似性,且具有5个hsp90家族保守区域以及C端共有氨基酸序列MEEVD。hsp90存马氏珠母贝外套膜、鳃、肝腴腺、闭壳肌、性腺和腹足中均有表达,性腺组织中表达量最高。3、芘胁迫对马氏珠母贝鳃组织ahr、cyp4、hsp90表达有一定影响,不同基因的表达水平对芘胁迫的响应表现出时间差异性：染毒后第3d,三个基因的表达水平表现相同的变化趋势,在高浓度组32μg·L-1,ahr、cyp4基因的表达与对照组相比有极显著差异(p<0.01)；染毒后第5d,ahr表达水平与对照组相比受到极显著诱导(p＜0.01),cyp4和hsp90基因表达水平具有相同趋势,低浓度的表达较为明显；染毒后第7d,8和16μg·L-1浓度组hsp90受到极显著诱导(p<0.01),ahr、cyp4基因表达水平随芘染毒时间延长呈现下调的趋势。4、通过比较(Lowestobservedeffectconcentration,LOEC)发现,在抗氧化酶指标中,可选用较为敏感的POD和GPx作为生物标志物,在芘与ahr介导的马氏珠母贝解毒代谢相关基因表达中,ahr和cyp4基因较为敏感,可以作为分子生物标志物来指示海洋中芘污染,从而为海洋PAHs的污染提供早期预警。
【作者】杜俊俏；
【导师】刁晓平；
【作者基本信息】海南大学，生态学，2014，硕士
【关键词】芘；马氏珠母贝；抗氧化酶；基因克隆；生物标志物；

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