miR-193b在胰腺癌中表达及功能的初步研究

miR-193b在胰腺癌中表达及功能的初步研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-26 分类:期刊论文 喜欢:2191
师大云端图书馆

【摘要】研究背景:胰腺癌(PC)是最致命的恶性肿瘤之一,居全世界癌症相关死亡原因第8位。胰腺癌预后差的主要原因是早期缺乏特异性临床症状、无有效的早期诊断标志物、早期转移及对标准的放化疗效果差。胰腺癌发生机制复杂,目前尚不十分明确,寻找新的诊断治疗靶点是胰腺癌研究的重点。microRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA,长度为19-24nt,它能在转录后水平抑制靶基因的表达或翻译,广泛地参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等重要的生物学过程。大量文献表明microRNA可作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生和发展。因此深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达及其功能,对探索肿瘤的发病机制具有重要意义,并将有利于对肿瘤的诊断、治疗及预后的判断。miR-193b由位于16p13.12上的基因所编码,目前已有不少研究报道miR-193b在多种人类恶性肿瘤中的表达失调并与肿瘤的发生发展密切相关,如宫颈肿瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、急性淋巴细胞白血病等,提示miR-193b可能在人类恶性肿瘤中发挥着重要的作用。IkedaY等研究发现miR-193b是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关miRNA,外源性过表达miR-193b能抑制培养胰腺癌细胞的增殖,表明miR-193b可能参与了PC发生发展并扮演着重要作用。然而,目前关于miR-193b在人胰腺癌组织中的表达及生物学作用机制尚不明确。目的:检测人胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中miR-193b和STMN1的表达的情况,分析二者在胰腺癌组织中表达的相关性和STMN1蛋白表达与胰腺癌患者临床病理因素及根治性胰腺癌术后患者预后之间的关系;探讨miR-193b和STMN1(癌蛋白18)在胰腺癌发生发展及侵袭转移中的相关功能机制并验证miR-193b对STMN1的靶向调节作用。方法:1.收集新鲜胰腺癌组织及与其配对的癌旁组织、胰腺癌细胞系并收集胰腺癌石蜡切片及正常胰腺组织。实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测miR-193b、STMN1mRNA在胰腺癌组织和细胞系中表达,分析两者在胰腺癌组织中表达相关性;Westernblot检测STMN1蛋白在人胰腺癌组织和细胞系中表达;免疫组化检测STMN1蛋白在胰腺癌中表达情况,分析STMN1蛋白表达与胰腺癌临床病理因素及根治性胰腺癌术后患者预后之间的关系。2.将hsa-miR-193bmimic使用脂质体Lipofectamine2000转染入Panc-1细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组。Real-timePCR检测转染hsa-miR-193bmimic后Panc-1细胞中miR-193b表达情况。分别运用MTT法、流式细胞术和Transwell法检测表达上调miR-193b后对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。用westernblot方法检测上调miR-193b后STMN1蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证STMN1是miR-193b的下游直接靶基因。3.购买针对STMN1的特异性siRNA,通过脂质体LipofectamineTM2000转染Panc-1细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组。实时荧光定量PCR(Real-timePCR)和Westernblot检测STMN1-siRNA对STMN1表达的影响;分别运用MTT法、流式细胞术和Transwell法检测沉默STMN1表达后对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。Westernblot检测转染STMN1-siRNA后Panc-1细胞中α微管蛋白及乙酰化α微管蛋白表达水平。结果:1.miR-193b在人胰腺癌组织中表达明显低于癌旁胰腺组织及正常胰腺组织,miR-193b在TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期的胰腺癌组织中表达较Ⅰ期和Ⅱ期的胰腺癌组织中表达明显低。同时miR-193b在人胰腺癌细胞系中表达较正常胰腺组织明显低。2.生物信息学软件预测STMN1为miR-193b潜在下游直接靶基因。3.STMN1mRNA和蛋白在胰腺癌组织中表达明显高于癌旁组织;STMN1mRNA和蛋白在胰腺癌细胞系中表达明显高于正常胰腺组织。4.免疫组化结果显示STMN1蛋白在胰腺癌中高表达,主要表达在细胞浆中,而在正常胰腺组织中主要为阴性表达;STMN1蛋白表达水平与胰腺癌的病理分级、淋巴结转移、TNM分期相关;STMN1蛋自阳性表达组根治性胰腺导管腺癌患者的生存率明显低于阴性表达组;单、多因素分析显示STMN1是根治性胰腺癌术后患者预后的独立危险因素。5.人胰腺癌组织中miR-193b和STMN1mRNA表达呈明显负相关。6.通过转染miR-193bmimic成功上调了Panc-1细胞内miR-193b表达水平,miR-193b能明显下调STMN1蛋白的表达,双荧光素酶报告基因实验证实STMN1是miR-193b下游直接靶基因。7.上调Panc-1细胞内miR-193b表达可抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭并促进细胞凋亡。8.通过转染STMN1-siRNA沉默Panc-1细胞中STMN1表达,Real-timePCR和Westernblot显示STMN1-siRNA可抑制STMN1表达,沉默Panc-1细胞内STMN1表达可抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭并促进细胞凋亡;沉默STMN1表达上调了Panc-1细胞中乙酰化α微管蛋白的表达水平。结论:1.miR-193b在胰腺癌组织及细胞系中均低表达。2.STMN1在胰腺癌组织及细胞系中均高表达,STMN1蛋白表达与病理分级、淋巴结转移、TNM分期及根治性胰腺癌术后患者差的预后明显相关,STMN1是根治性胰腺癌术后患者独立危险因素。3.胰腺癌组织中miR-193b与STMN1mRNA表达呈明显负相关。4.miR-193b能直接靶向下调STMN1蛋白表达并抑制Panc-1细胞增殖、迁移和侵袭,同时促进细胞凋亡。5.STMN1能下调Panc-1细胞中叶微管蛋白乙酰化水平,促进微管解聚,同时促进Panc-1细胞增殖、迁移和侵袭、抑制细胞凋亡。
【作者】李建;
【导师】孙维佳;
【作者基本信息】中南大学,临床医学,2014,博士
【关键词】胰腺癌;miR-193b;癌蛋白18;增殖;侵袭转移;预后;

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