肝硬化门脉高压时青藤碱促奥曲肽空肠胞旁吸收机制研究

【摘要】中国肝硬化人口十分庞大，而门脉高压是肝硬化失代偿期患者典型的临床表现，又是肝硬化多种并发症发生的根源及致死的主因。对门脉高压进行积极有效防治是改善患者预后及降低病死率的关键，但目前尚无理想的口服药物来预防门脉高压。奥曲肽（octreotide,OCT）是目前公认的治疗肝硬化门脉高压的有效药物，虽可抵抗胃肠道中酸、酶的降解，但因分子量大，脂溶性差，受肠粘膜屏障和肝肠首过效应的影响，口服生物利用度极低，临床上仅限于注射给药，不利于作为预防性药物长期应用。OCT口服可以避免长期反复注射给药带来的痛苦和不便，临床意义重大。我们期待能像治疗高血压一样，实现OCT口服，达到早期、持续服药来防治门脉高压。国内外学者对此做了大量工作，但仍无任何一项研究成果可应用于临床。本课题组前期实验建立了部分门脉结扎的门脉高压大鼠模型，证实广泛侧支循环的建立可有效地降低OCT肝首过效应，故肝首过效应并非门脉高压下OCT口服吸收的主要障碍。随后，又进一步研究了肝硬化门脉高压状态时空肠首过效应中起着关键作用的转运蛋白P-糖蛋白（p-glycoprotein,P-gp）、多耐药相关蛋白2（multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2）和代谢酶细胞色素P4503A4（cytochromeP4503A4,CYP3A4），探讨了抑制肠上皮首过效应来增加OCT肠吸收的机制，故肠上皮首过效应问题也可得到解决。而对于OCT肠吸收至关重要的胞旁吸收途径则是本次研究的重点。本研究通过对肝硬化门脉高压大鼠空肠粘膜的形态学及分子水平的研究表明，门脉高压状态时空肠上皮紧密连接（tightjunction,TJ）蛋白Claudin-1表达减少，TJ松弛，肠粘膜屏障功能破坏，可使肠壁通透性增加，利于OCT的肠吸收。而通过Caco-2细胞模型证实促吸收剂青藤碱（sinomenine,SN）能够通过激活蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）信号转导通路来调控TJ蛋白Claudin-1的表达，实现短暂可逆的调节胞旁TJ，有效提高OCT在Caco-2细胞单层中的渗透率。预实验初步证实SN能够增加正常大鼠OCT的肠吸收率，本研究则进一步在肝硬化门脉高压大鼠体内及体外吸收模型上证实SN有效的提高了OCT口服生物利用度，且在肝硬化门脉高压状态时其促吸收效果更为显著。本研究旨在通过细胞及动物实验，揭示SN可逆性调控胞旁TJ促进OCT肠吸收的机制，为提高OCT口服生物利用度提供有效可行的方法及途径，为OCT临床合理用药提供理论依据，为实现口服OCT预防门脉高压开创新纪元。本研究共分三部分第一部分青藤碱可逆调控肠上皮细胞紧密连接促奥曲肽吸收的机制研究第二部分肝硬化门脉高压对大鼠空肠上皮细胞紧密连接影响的研究第三部分肝硬化门脉高压时青藤碱促奥曲肽空肠吸收研究第一部分青藤碱可逆调控肠上皮细胞紧密连接促奥曲肽吸收的机制研究目的：在Caco-2细胞单层模型上评估SN对OCT肠吸收的影响，明确SN可逆调控肠上皮细胞TJ的分子机制。方法：1.建立Caco-2细胞单层模型，并通过形态学、跨膜电阻（transepithelialelectricalresistance,TEER）测量及胞旁漏出标记物异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐-4000（FD-4）的渗透量来考察Caco-2细胞单层的完整性。2.通过乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）试验考察不同浓度组（0.5%、1%、2%w/v)SN对Caco-2细胞单层的损伤情况。3.通过TEER的测量及FD-4渗透量的计算明确SN对TJ的可逆性调节作用。4.SN对OCT肠吸收的影响。分组：Control组（10μMOCT）；SN组（0.5%SN+10μMOCT）。考察各组OCT的表观渗透系数（apparentpermeabilitycoefficient,Papp）。5.SN对TJ蛋白Claudin-1表达的影响。分组为：Control组；SN组（0.5%SN）、SN去除组（SNremoval）及PKC抑制剂组(0.5%SN+10μMRo318220)。运用蛋白免疫印迹（westernblot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time-PolymeraseChainReaction,Real-Time-PCR）、免疫荧光染色（ImmunofluorescentStaining,IF）方法分别考察各组中Claudin-1的表达。6.SN对PKC信号转导通路的影响。分组：Control组，SN组（0.5%SN），运用westernblot的方法分别考察PKC-α在对照组及SN组中细胞膜及胞浆中的表达。结果：1.细胞培养21天后，倒置显微镜可见细胞之间的接触；经过测量和计算，Caco-2细胞单层的TEER值均达到700Ω·cm2以上；1mg/ml的FD-4在120min内的渗透量（AP-BL侧）无明显变化，一直处于较低水平（<0.5pmol/cm2），说明细胞间已形成完整的TJ。2.LDH试验显示120min后，中浓度组（1%）及高浓度组（2%）的SN对细胞均有损伤，与对照组相比P<0.05；而低浓度组（0.5%）SN对细胞无明显损伤，与对照组相比P>0.05。3.0.5%SN作用120min时，TEER%降至最低点，为起始TEER值的43%，FD-4的流出量达到最高，与对照组相比，P<0.05；去除SN的作用后，TEER%又迅速回升，在SN去除120min（总时间的240min）时恢复到起始水平，与对照组相比，P>0.05。4.共同给予0.5%SN和10μMOCT120min时，OCT的Papp为5.89±0.038×106cm/s，是对照组（单给10μMOCT）的2.2倍（P<0.05）。5.IF显示Control组中Claudin-1蛋白均匀表达于细胞膜，显示较强的绿色荧光；0.5%SN作用120min后，绿色荧光强度明显减弱，细胞间的连接出现断断续续的改变；去除SN120min时，细胞膜上的绿色荧光再次增强，细胞间的TJ完整性又恢复；而在SN+Ro318220共同作用120min时，细胞膜上的绿色荧光强度及细胞间TJ形态较给药前无明显变化。Westernblot及Real-Time-PCR结果显示，0.5%SN组较Control组Claudin-1蛋白表达明显降低（P<0.05），SNremoval组及0.5%SN+10μMRo318220组Claudin-1蛋白表达均较Control组无明显差异（P>0.05）。6.对照组中，PKC-α蛋白主要在细胞质内表达，细胞膜上表达量很少；而0.5%SN组，PKC-α则从细胞质中转移出来，主要表达于细胞膜上，表达量与Control组相比具有统计学意义(P<0.05)，这种PKC-α的转膜现象意味着PKC通路的激活。结论：1.在Caco-2单层细胞模型上，SN能够促进OCT的吸收。2.TJ蛋白Claudin-1在SN可逆性调控TJ中发挥着重要作用，且很可能与PKC信号转导通路的激活有关。第二部分肝硬化门脉高压对大鼠空肠上皮细胞紧密连接影响的研究目的：在肝硬化门脉高压大鼠模型上，从形态学及分子水平对OCT胞旁吸收途径的主要结构—TJ进行研究，探讨肝硬化门脉高压对肠粘膜屏障的影响及机制。方法：大鼠肝硬化门脉高压模型采用胆总管结扎（bileductligation,BDL）方法来制备。将健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为2组，即Control和BDL组。BDL术后4周，对2组大鼠进行门静脉压力测定，之后处死大鼠，取血、取肝、取空肠，采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)水平；HE染色观察肝脏病理形态学；透射电镜（transmissionelectronmicroscope,TEM）观察空肠上皮细胞间TJ形态；免疫组织化学染色（ImmunohistochemistryStaining,IHC）、westernblot及Real-Time-PCR方法观察大鼠空肠Claudin-1蛋白及基因表达情况。结果：1.大鼠门脉压力比较，BDL组较Control组明显升高（P<0.01）；对比ALT和AST值，BDL组较Control组明显升高(P<0.01)。2.大鼠肝脏HE染色结果显示BDL组肝小叶结构紊乱，大量纤维组织增生，炎性细胞侵润，见多个假小叶，小叶间胆管增生明显。3．TEM观察显示BDL大鼠空肠上皮细胞间TJ松弛，细胞间隙增宽。4.IHC及westernblot结果显示BDL组Claudin-1蛋白表达较Control组降低（P<0.01）；Real-Time-PCR方法显示BDL组Claudin-1基因表达较Control组降低（P<0.01）。结论：肝硬化门脉高压大鼠空肠粘膜超微结构改变，TJ蛋白Claudin-1表达减少，TJ松弛，为增加OCT的胞旁渗透提供了可能。第三部分肝硬化门脉高压时青藤碱促奥曲肽空肠吸收研究目的：通过肝硬化门脉高压大鼠离体翻转肠、肠灌流及灌胃给药等多种药物吸收模型，明确SN在门脉高压状态时对OCT肠吸收的促进作用。方法：1.建立BDL大鼠模型，运用离体翻转肠实验，考察SN对浆膜侧OCT浓度影响。实验大鼠随机分组及给药浓度如下（n=4）：Control+OCT组：单给10μMOCT；Control+OCT+SN组：给予10μMOCT+0.5%SN；BDL+OCT组：单给10μMOCT；BDL+OCT+SN组：给予10μMOCT+0.5%SN。2.运用大鼠在体空肠灌流实验，考察SN对血中OCT浓度影响。分组及给药浓度同翻转肠实验。3.通过大鼠灌胃实验，考察SN对OCT生物利用度的影响。实验大鼠随机分组及给药浓度如下（n=4）：Control+OCT静脉给药组：每只大鼠单给OCT20μg；Control+OCT口服给药组：每只大鼠单给OCT200μg；Control+OCT+SN口服给药组：每只大鼠给予OCT200μg+SN30mg；BDL+OCT静脉给药组：每只大鼠单给OCT20μg；BDL+OCT口服给药组：每只大鼠单给OCT200μg；BDL+OCT+SN口服给药组：每只大鼠给予OCT200μg+SN30mg。结果：1.离体翻转肠实验，对比OCT浓度，BDL+OCT+SN组较BDL+OCT组明显升高(P<0.05)；Control+OCT+SN组较Control+OCT组明显升高(P<0.05)；BDL+OCT+SN组较Control+OCT+SN组也有所升高(P<0.05)；BDL+OCT组与Control+OCT组无明显差异(P>0.05)。2.体空肠灌流实验，对比OCT浓度，结果同离体翻转肠组。3．口服吸收组均于给药后30min出现峰值，对比Cmax，Control+OCT+SN组是Control+OCT组的3.6倍（P<0.05）；BDL+OCT+SN组是BDL+OCT组的7.0倍（P<0.05），是Control+OCT+SN组的1.6倍（P<0.05），而Control+OCT组和BDL+OCT组无明显差异（P>0.05）。对比AUC,Control+OCT+SN是Control+OCT组的4.8倍（P<0.05）；BDL+OCT+SN组是BDL+OCT组的6.8倍（P<0.05），是Control+OCT+SN组的1.4倍（P<0.05），而Control+OCT组和BDL+OCT组的无明显差异（P>0.05）。对比绝对生物利用度（absolutebioavailability,F），Control+OCT+SN组是Control+OCT组的3.79倍（P<0.05）；BDL+OCT+SN组是BDL+OCT组的6.76倍（P<0.05），是Control+OCT+SN组的1.6倍（P<0.05），而Control+OCT组和BDL+OCT组的无明显差异（P>0.05）。静脉对照组大鼠均在给药后10min出现峰值，Control+OCT组与BDL+OCT组的Cmax和AUC均无明显差异（P>0.05）。结论：1.在大鼠离体与在体实验中，BDL大鼠与正常大鼠OCT肠吸收率及生物利用度无明显差异。2.在大鼠离体与在体实验中，无论是BDL大鼠还是正常大鼠，SN均能提高OCT的肠吸收率及口服生物利用度，且在BDL大鼠中SN的促吸收作用更为显著。
【作者】李钰伶；
【导师】段志军；
【作者基本信息】大连医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】青藤碱；紧密连接；奥曲肽；肠吸收；肝硬化门脉高压；空肠；生物利用度；

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