新型DNA自组装模块构建、杂交性能及分析应用

【摘要】脱氧核糖核酸(DNA)具有良好的生物相容性和化学稳定性,易于进行化学修饰,其碱基序列的互补配对杂交具有高度的特异性和可设计性,因此,在生物传感以及纳米自组装等领域受到越来越多的关注并得到重要应用。本博士论文围绕与DNA相关的新型自组装模块的构建、杂交性能研究以及其分析应用等几个方面展开研究工作,具体如下：DNA功能化纳米粒子在纳米材料自组装,药物传递,化学与生物传感,以及生物成像等方面获得了重要应用。银纳米粒子由于其等离激子光学特性,拉曼增强活性、抗菌性能以及在纳米催化和金属团簇发光等方面的性质与应用,已经成为一种重要的金属纳米材料。然而,银纳米粒子相对较差的化学和胶体稳定性使得其稳定、可靠的DNA修饰成为一个难题。因此,发展一种简单、有效、可批量合成高稳定性银纳米粒子的方法,并探索其价态(粒子表面DNA分子数目)可控的DNA修饰,对于纳米粒子超结构的DNA程序化控制组装以及相关性能研究具有重要的意义。面向这一目标,我们以短片段鱼精DNA为模板合成出高度稳定的水溶性银纳米粒子,所得银纳米粒子平均直径为2nm,且粒径分布相对均匀。由于鱼精DNA的保护作用,这种银纳米粒子具有非常好的耐盐性,可以在3M醋酸钠溶液,或者300mM醋酸镁溶液中稳定存在,不发生聚集。这种优异的耐盐性对于基于DNA的纳米粒子自组装非常重要,这是因为复杂的DNA结构通常需要高盐浓度以保证其碱基配对足够稳定。更重要的是我们合成的这种银纳米粒子在琼脂糖凝胶电泳中呈现窄分布的单一样品条带,十分有利于通过凝胶电泳对其不同价态的DNA修饰产物进行分离与纯化。基于此,我们使用易得的具有单巯基末端的DNA序列,成功实现了银纳米粒子表面特定数目DNA分子的功能化,通过不同价态的修饰产物在琼脂糖凝胶电泳时电泳迁移率的显著差异,首次成功实现了离散型DNA功能化银纳米粒子的电泳分离与纯化,得到了一种新的DNA功能化纳米组装模块,为进一步研究其自组装性能与应用提供了可能性。本工作还通过对纯化的单一价态DNA修饰产物进行表征,清楚地揭示了使用多巯基修饰DNA对于形成稳定的银纳米粒子DNA修饰产物十分必要,这一结论对于进一步探索银纳米粒子的生物和化学功能化以及发展相关应用具有重要的指导意义。监测并调控DNA在纳米粒子表面的杂交动力学在生物传感,纳米材料组装等领域具有非常重要的意义。传统方法采用高密度修饰的金纳米粒子研究DNA在其表面的杂交动力学行为,这种研究手段具有一定的局限性。例如,高密度修饰方法只能控制纳米粒子表面的平均DNA覆盖率,而不能控制纳米粒子表面DNA分子的精确数目,且在测定DNA修饰密度时由于需要多步实验操作容易产生较大的误差。另一方面,DNA多功能化金纳米粒子彼此之间发生杂交反应时,其产物具有很宽的分布,且杂交过程涉及较多的物理和化学因素,不适合对杂交反应进行定量研究和理论处理。为此,我们提出使用DNA单功能化修饰的金纳米粒子来研究DNA在纳米粒子表面的杂交动力学。除上述原因外,DNA单功能化纳米粒子同时也是利用DNA程序化组装各种精确、复杂的纳米材料与纳米结构的重要构建单元,并且在化学和生物传感方面逐渐受到关注。因此,研究单功能化纳米粒子表面的DNA杂交动力学具有十分重要的意义。我们设计了四种不同的DNA序列并实现了它们在金纳米粒子表面的单功能化,采用凝胶电泳分析和表征单链修饰策略与部分双链修饰策略所对应的DNA单功能化金纳米粒子的杂交动力学行为及二者之间的差异。得益于这一研究体系所对应的杂交反应物和产物明确且单一,可以非常方便地采用二级化学反应动力学模型对所得数据进行拟合和处理,得到不同DNA序列在单功能化金纳米粒子表面的杂交反应速率常数。实验结果揭示了纳米粒子表面DNA杂交动力学的复杂性,证明了杂交反应具有十分明显的序列依赖性和温度依赖性。这一结论可以为科研工作者提供DNA自组装和DNA生物传感等方面的实验设计指导,并为今后研究其他DNA序列在纳米粒子表面的杂交动力学行为提供一种可供选用的理想方法。近年来在DNA纳米技术中发展起来的以种子DNA链为“引发剂”的DNA自组装过程得益于一种新型的亚稳态DNA自组装模块的出现,目前已被成功用于模仿动态的化学和生物过程,并且在DNA纳米机器方面也具有重要应用前景。这种特殊的DNA自组装过程(也称为DNA自聚合反应)已经被用于构建荧光DNA传感器,但在电化学传感器中的应用尚未见报道。基于此,我们将这种可在表面引发的DNA自组装过程用作DNA电化学传感器的信号放大手段,从而可避免电化学信号放大策略中通常涉及的酶分子或者纳米粒子,避免了纳米粒子和酶使用所引起的各种问题,如：蛋白与纳米粒子在电极表面吸附较强,酶价格昂贵且容易失活,纳米粒子在使用和存放过程中容易聚集等等。本工作设计的这种电化学信号放大策略,实现了一次目标分子杂交事件引发多个DNA单体发生聚合反应,大大提高了单个目标分子杂交所产生的电化学信号。另外,这种DNA自组装是由结合在电极表面的种子链引发的,因此,整个自组装过程都限定在异相电极-溶液界面处进行,而均相溶液中单体之间发生的不可控组装可以被避免。在非最优的条件下,实现了目标DNA序列4.9pM的检测限,与传统的未经放大的三明治结构DNA电化学传感器相比,检测限降低300多倍,并且具有很好的单碱基错配分辨能力。这种新型的信号放大策略也可以应用到其他生物大分子(如蛋白质)或者小分子的检测。
【作者】郑园琴；
【导师】邓兆祥；
【作者基本信息】中国科学技术大学，分析化学，2012，博士
【关键词】脱氧核糖核酸；银纳米粒子；稳定性；鱼精DNA；价态控制；电泳分离；杂交动力；学单功能化；金纳米粒子；速率常数；DNA；自组装；电化学检测；信号放大；单碱基错配；

【参考文献】
[1]洪敏.北京市土地利用动态变化的研究[D].中国农业大学,土地资源管理,2004,硕士.
[2]宿非凡,王瑞峰.全铌超导Josephson结的EWB仿真模型[J].大学物理实验,2014,03:27-31.
[3]余宁.重组鸡IL-18复合免疫增强剂对新城疫疫苗免疫增强作用的研究[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[4]陈慧.CRM如何满足IT媒体的需求[J].电子商务世界,2001,08:60-61.
[5]王磊.《大英百科年鉴1996·国际事务》翻译实践报告[D].郑州大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[6]刘重.我国软件类上市公司股权激励业绩指标的重构[D].东北大学,会计学,2010,硕士.
[7]郭永宏.定边采油厂油田生产精细化管理模式研究[D].西北大学,高级工商管理（EMBA）（专业学位）,2014,硕士.
[8]张尧.颈动脉支架置入术后过度灌注综合征的危险因素研究[D].南京大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[9]王海兵.我国会计信息市场研究[D].武汉理工大学,会计学,2003,硕士.
[10]葛沧.永磁风力发电控制系统及低电压穿越的研究[D].哈尔滨理工大学,电力系统及其自动化,2012,硕士.
[11]阳烁今.演变中的城市综合体建筑外部环境设计研究[D].湖南大学,建筑学,2012,硕士.
[12]张保动.掘进机第一运输机的动力特性分析[D].辽宁工程技术大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[13]杨学兵,陆勤,蔡庆生.一种高效的挖掘序贯模式的算法[J].小型微型计算机系统,2001,02:201-203.
[14]熊高君,贺振华,黄德济,阎贫,姜绍仁,张毅祥.三维混合延拓一步法波动方程深度偏移[J].石油地球物理勘探,1998,04:477-485+572.
[15]代贤俊.面向写作辅助的中文智能输入法系统[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2014,硕士.
[16]万娟.铁粉芯与铁基非晶磁粉芯的制备及软磁性能研究[D].华南理工大学,材料工程,2012,硕士.
[17]侯春晓.水稻木聚糖酶抑制蛋白的功能和表达模式研究[D].浙江大学,植物学,2014,博士.
[18]徐翔宇.基于Flex与ArcGIS Server的建设用地监管系统设计与实现[D].华中农业大学,资源环境信息工程,2014,硕士.
[19]张茂林.太原市教学与管理杂志社稿件管理系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[20]邓之银.基于拉曼光谱的油品快速检测技术与实验研究[D].浙江大学,光学工程,2014,硕士.
[21]刘业政,胡剑.商业智能的核心技术及体系结构研究[J].合肥工业大学学报(自然科学版),2004,08:882-885.
[22]朱智军.复杂电气信号相量测量方法研究[D].湖南大学,电力系统及其自动化,2012,硕士.
[23]刘博.黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞及其耐药细胞株体外抑制作用的研究[D].河北大学,外科学,2014,硕士.
[24]张党磊.罕遇地震下既有建筑增加大跨钢结构层后的抗震性能分析[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[25]彭艺.论个人信息的民法保护[D].首都经济贸易大学,民商法,2014,硕士.
[26]黄军高,王首顶,凌强,陈伟,杨斌.时间序列数据库在地区电网调控一体化系统中的应用[J].电力系统自动化,2011,23:107-111.
[27]张改娜.高阳民众教育思想研究[D].西南大学,中国教育史,2014,硕士.
[28]张煜.马鞍山石油分公司非油品业务经营模式研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[29]刘宁.嗅鞘细胞移植治疗大鼠马尾神经压迫损伤的初步研究[D].第二军医大学,外科学,2013,硕士.
[30]葛滢,常杰,陆大根,岳春雷.杭州石荠苧生态学特性的研究[J].植物生态学报,1999,01:15-23.
[31]黄任群.不同类型产业集群发展影响因素比较研究[D].浙江大学,2006.
[32]高金枝.农村教师信息技术应用能力“四位一体”培训模式研究[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[33]孙元欣.异基因造血干细胞移植后aGVHD与调节性T细胞、IL-35、TREC的相关性分析[D].山东大学,内科学,2013,硕士.
[34]龚长寿.热电联产工程冷却塔的设计[D].四川大学,化学工程,2003,硕士.
[35]孙天.基于Retinex理论的复杂光照下的人眼检测系统研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[36]张丽娟.1.NESCs和ICC肠壁内共移植治疗HSCR的实验研究2.IL-6/STAT3蛋白表达与Wilms瘤进展的关系[D].山东大学,儿科学,2014,博士.
[37]李晓鹏.清代咸丰朝医案之方药研究[D].黑龙江中医药大学,方剂学,2014,硕士.
[38]毛文斌.基于人工神经网络的高维遥感数据分类研究[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[39]王金梅.轴向运动粘弹性夹层结构热弹耦合振动研究[D].西南交通大学,一般力学与力学基础,2014,硕士.
[40]杨为伟.晚期结直肠癌维持期中药治疗疗效观察[D].北京中医药大学,内科学,2014,硕士.
[41]张调风.基于改进的SSEB模型区域蒸散发遥感反演及其在干旱评估中的应用[D].西北师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[42]周建文.关于参加中国第一口大陆科学深钻研究项目的建议[J].石油地球物理勘探,1992,03:317.
[43]何磊.重庆市人为汞散发和自然释放通量研究[D].西南农业大学,环境工程,2004,硕士.
[44]王京.超声引导下经颈内静脉置入植入式输液港的临床应用与研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[45]李清华.Ataxin-3对Parkin（C289G）的作用及其与去泛素化酶活性的关系[D].桂林医学院,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[46]刘宁.4-甲氧基间苯二甲酰胺类化合物的合成及活性研究[D].天津理工大学,药物化学,2013,硕士.
[47]崔士博.基于四元数据傅里叶变换的彩色图像数字水印算法[D].吉林大学,计算数学,2013,硕士.
[48]程慧娟.鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤中NF-κBp65、HIF-1α、MMP-9的表达及其与血管生成的关系[D].郑州大学,耳鼻咽喉头颈外科,2013,硕士.
[49]刘坤平,李惠茗,何钢,颜军,苟小军.明胶功能化石墨烯制备及吸附去除水中罗丹明B的动力学研究[J].化学研究与应用,2013,07:1006-1011.
[50]李建东.论人民币国际化的风险与对策[D].中共中央党校,世界经济,2013,硕士.