miR-27a在红系分化中的作用机制

【摘要】目的：观察K562细胞在向红系分化过程中miR-27a的表达变化，分析miR-27a的靶基因CDC25B在红系分化中的具体作用机制。通过分析miR-27a与CDC25B的表达变化及转染K562细胞后miR-27a、CDC25B与γ-globin的表达变化，初步探讨miR-27a在红系原始分化中的表达及其作用及调控机制。方法：在不同时间点（0、3、6、12、24、48h）用hemin(氯高铁血红素，30nM)诱导K562细胞向红系分化后提取RNA后做定量PCR观察γ-globin、miR-27a的表达变化。将CDC25B的3’UTR区可能与miRNA作用的位点克隆到荧光报告基因的下游，与miR-27a共同转染293T细胞后，观察过表达miR-27a对荧光素酶表达的影响。瞬时脂质体转染293T细胞过表达miR-27a和抑制表达miR-27a后分别提取蛋白和RNA做westernblot与定量PCR观察CDC25B的变化。脂质体瞬时转染CDC25BsiRNA、miR-27amimics、miR-27ainhibitor.。使用后hemin诱导后用定量PCR检测γ-globin的表达变化。结果：K562细胞株在不同时间点加入hemin刺激后提取RNA，随着时间的增加，miR-27a与γ-globin表达量成阶段性上升，但在48h时开始下降。CDC25B的表达逐渐降低。双荧光报告基因实验结果显示，miR-27a能够使CDC25B3’UTR区的报告质粒荧光素酶荧光值降低，说明miR-27a能抑制CDC25B的表达，由此推断，CDC25B可能是miR-27a的靶基因。瞬时转染过表达miR-27a和抑制表达miR-27a后分别提取蛋白质和RNA做westernblot和实时荧光定量PCR后发现过表达miR-27a后CDC25B的蛋白表达与RNA表达下降，反之抑制miR-27a后CDC25B的蛋白与RNA表达上升，以上结果证明CDC25B是miR-27a的靶基因。转染CDC25BsiRNA、miR-27amimics、miR-27ainhibitor使用hemin诱导后用定量PCR检测γ-globin；显示转染CDC25BsiRNA与miR-27amimics组，γ-globin表达逐渐上升，而转染miR-27ainhinbitor后，γ-globin表达虽然也成阶段性上升，但与对照组相比较其表达在hemin处理不同时间点明显降低。结论：基于上述研究，miR-27a与γ-globin随着K562向红系分化表达逐渐上升，在48h开始下降。Westernblot和双荧光基因报告实验显示CDC25B是miR-27a的靶基因，参与调节红系分化。在转染了miR-27amimics后使用hemin诱导，γ-globin的表达随着的不同时间点逐渐上升，但抑制miR-27a后γ-globin虽然也逐渐升高，但与对照组相比较，其表达在hemin处理不同时间点明显降低，说明miR-27a在红系分化过程中促进红细胞分化。CDC25B是miR-27a的靶基因，抑制其表达后，K562细胞向成熟红细胞分化，与过表达miR-27a结果一致，说明miR-27a可能是通过CDC25B发挥促进红系分化的作用。本文初步探讨了miR-27a在红系分化中的表达及作用，为进一步明确白血病的发病机制与治疗提供新的思路和新的方法。
【作者】斯思；
【导师】张国元；
【作者基本信息】川北医学院，临床检验诊断学，2014，硕士
【关键词】K562细胞；miR-27a；CDC25B；γ-globin；hemin；

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