SVCV糖蛋白在昆虫细胞中的表达及SVCV和IHNV抗体库的筛选

【摘要】鲤春病毒血症(Springviremiaofcarp,SVC)是一种由鲤春病毒血症病毒(Springviremiaofcarpvirus,SVCV)引起的严重的传染性急性流行病,主要影响鲤科鱼类。传染性造血器官坏死症(InfectiousHematopoieticNecrosis,IHN)是一种北半球鲑鱼科常见的传染性急性病毒病,由传染性造血器官坏死症病毒(InfectiousHematopoieticNecrosisVirus,IHNV)引起。SVCV和IHNV均属于弹状病毒科病毒。一旦发病,染病鱼类死亡率高达70%-90%,对世界水产养殖业造成巨大的经济损失。SVCV糖蛋白是SVCV最主要抗原,并携带病毒中和表位,糖蛋白基因是研制基因工程抗体的候选基因。本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功的表达了SVCVG基因,对深入研究SVCV糖蛋白的生物学活性具有重要意义。噬菌体抗体技术具有操作简单,筛选周期短,并能获得高亲和力的特异性抗体等优点。因此,噬菌体抗体展示技术广泛的应用于抗体筛选。本实验利用杆状病毒表达系统表达SVCV糖蛋白。将SVCV糖蛋白基因(G)插入到质粒pFastBacHTA中,再将构建的质粒pFastBac-G转化EcoliDh10αBac感受态细胞,经蓝白斑筛选,获得含G基因的重组质粒Bacmid-G。通过脂质体介导将Bacmid-G转染对数生长期的SF9细胞,收获转染上清获得重组杆状病毒AcNPV-G。AcNPV-G感染Sf9细胞,超声破碎后离心取上清进行SDS-PAGE及WesternBlot试验,结果显示蛋白条带大小约为57kDa,并能与羊抗SVCV血清发生特异性反应。间接免疫荧光试验结果显示在感染重组病毒的Sf9细胞中观察到荧光信号。试验结果表明,SVCV糖蛋白在Sf9细胞中获得成功地表达,且具有良好的免疫学活性。应用噬菌体抗体展示技术,经过3轮富集筛选后从噬菌体抗体库中获得8株抗SVCV单链抗体(scFv),且均为可溶性抗体。Dotblot分析结果表明,可溶性单链抗体能特异性识别SVCV:Westernblot结果显示单链抗体的分子量约为29kDa,8个抗体中仅P2H12能识别变性的SVCV.间接免疫荧光试验结果显示8株单链抗体均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。特异性试验结果表明单链抗体不与其他几种病毒蛋白发生交叉反应。以纯化的IHNV为抗原从噬菌体抗体库中成功筛选到6株抗IHNV的单链抗体。Westernblot结果显示单链抗体分子量大小约为32kDa。Dotblot结果表明6株单链抗体均能识别IHNV.间接ELISA试验结果表明,6株单链抗体均不与PFRV.STIV.VHSV及VNNV发生交叉反应,但单链抗体P1A4、P1A12、P1D5和P3E2与SVCV发生交叉反应。间接免疫荧光结果表明在感染]IHNV的细胞病灶检测到了荧光信号。本研究期望能为IHNV诊断试剂的研究奠定基础。
【作者】刘红；
【导师】吴志新；刘荭；
【作者基本信息】华中农业大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】鲤春病毒血症病毒；传染性造血器官坏死症病毒；弹状病毒；杆状病毒表达系统；噬菌体展示；糖蛋白；单链抗体；

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