齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系

【摘要】随着恶性肿瘤的发病率和死亡率的不断增加，抗肿瘤药物的研发成为当今生物医学界面临的重大课题。由于天然抗肿瘤药物具有高效、低毒等优点，所以从天然产物中筛选出有效的抗肿瘤药物是药物研发的重要手段。五环三萜类化合物在抗肿瘤药物的发展中起到不可忽视的作用。齐墩果酸（Oleanolicacid，OA）是天然的五环三萜类化合物之一，已经用作抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎制剂等。最近，许多齐墩果酸衍生物主要是针对齐墩果酸C3、13位双键、A环和C28等官能团的结构修饰，以提高齐墩果酸衍生物的抗肿瘤活性和降低其对正常细胞的毒害作用。本研究对已合成的2-氨基嘧啶齐墩果酸（化合物4）和1，2-噁唑齐墩果酸（化合物5）的抗肿瘤作用机制研究如下：1）利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测化合物4、5对K562细胞的细胞毒性作用。化合物4采用10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM，化合物5采用20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM6个浓度，以紫杉醇为阳性对照。K562细胞在不同浓度化合物下孵育72h后检测在490nm吸收值。结果显示化合物4、5显著抑制K562细胞的增殖，并呈浓度依赖的方式，IC50值分别为32.686μM和39.252μM。2）检测化合物对K562细胞形态学的影响。化合物4、5（20μM、40μM）处理K562细胞24h后，用Hoechst33342工作液染色30min，于荧光显微镜下看肿瘤细胞形态。结果显示化合物处理后，出现凋亡小体、核固缩、核裂解等细胞凋亡的典型特征。由此初步推测目的化合物通过凋亡途径抑制了K562细胞的增殖。3）采用流式细胞术检测化合物对K562细胞周期的影响。化合物4、5（40μM）处理细胞24h后，细胞用PI（50μg/mL）避光染色30min。流式细胞术检测结果显示化合物4、5处理细胞后，G1期细胞从29.89%（对照）分别增加41.65%和42.15%，初步推断化合物抑制细胞增殖与细胞周期阻滞在G1期有关。4）利用Westernblot的方法检测化合物对Bcl-2、Bax和聚ADP核糖聚合酶（PARP蛋白）、pAkt1表达的影响。化合物4、5以20μM、40μM、60μM的浓度处理K562细胞36h后，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，裂解PARP蛋白，抑制pAkt1蛋白的表达。5）通过Incellanalyzer1000分析稳转表达Akt1-EGFP的CHO细胞中Akt1在细胞内的分布情况。化合物4、5处理细胞1h后，加入16.7nM胰岛素，处理10min。利用InCellAnalyzer1000平台，高通量的捕捉并统计荧光标记的蛋白的数量及位置变化。发现化合物4、5以浓度依赖的方式抑制胰岛素刺激Akt1转移到膜上，从而影响Akt1在膜上磷酸化。6）构建重组载体pLJM1/Akt1，用嘌呤霉素筛选稳定过表达Akt1的K562细胞和Bel-7404细胞，利用MTT比色法检测目的化合物对其细胞毒性作用。结果显示化合物4、5通过浓度依赖的方式抑制细胞的增殖，IC50值分别为41.629μM和43.735μM。初步实验结果阐明该化合物具有一定逆转肿瘤细胞耐药性的潜在作用。本论文为齐墩果酸衍生物的结构优化提供了先导化合物和实验依据，为深入研究抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子作用机制提供了理论依据，为下一步新药的开发奠定基础。
【作者】潘姝花；
【导师】许传莲；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】齐墩果酸衍生物；抗肿瘤活性；细胞凋亡；Akt1；InCellAnalyzer；

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