1,25(OH)_2D_3抑制人卵巢癌细胞SKOV-3增殖和迁移及其相关机制探讨

【摘要】目的：研究1,25(OH)2D3对人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖、迁移的抑制作用及其相关机制，为卵巢癌防治提供新思路。方法：本研究主要包括三部分：(1)研究1,25(OH)2D3对SKOV-3的增殖抑制作用及其机制。以不同浓度1,25(OH)2D3(1、10、100nM)处理SKOV-3细胞，CCK-8法检测细胞增殖率，流式细胞仪分析细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡，免疫荧光检测维生素D受体（vitaminDreceptor,VDR）和β-catenin的表达，Westernblotting定量分析VDR、β-catenin、CCND1和FRAT1的表达。(2)以不同浓度1,25(OH)2D3(1、10、100nM)处理SKOV-3细胞，划痕实验及活细胞工作站系统分析细胞迁移能力，免疫荧光定性定位检测E-cadherin及Vimentin的表达，并利用WesternBlotting做定量分析研究1,25(OH)2D3对人卵巢癌细胞系SKOV-3的迁移抑制作用；以10ng/mlTGF-β处理SKOV-3细胞制作EMT模型，利用划痕实验及活细胞工作站系统分析细胞迁移及运动能力，免疫荧光定性定位检测EMT相关蛋白E-cadherin及Vimentin的表达，并利用WesternBlotting做定量分析；在此基础上研究1,25(OH)2D3对TGF-β诱导的EMT进程的影响。实验分为：对照组、TGF-β组、VD组、VD+TGF-β组，分别以溶剂对照、TGF-β(10ng/ml)、1,25(OH)2D3(100nM)、TGF-β(10ng/ml)+1,25(OH)2D3(100nM)处理SKOV-3细胞，通过划痕实验及活细胞工作站系统检测SKOV-3细胞迁移能力，Transwell侵袭实验分析细胞侵袭能力，免疫荧光检测VDR、Slug、Snail、β-catenin、E-cadherin和Vimentin的表达，Westernblotting定量分析VDR、Slug、Snail、β-catenin、E-cadherin和Vimentin的表达。(3)以100nM1,25(OH)2D3处理SKOV-3细胞，microRNA芯片分析差异表达的microRNAs，Targetscan及miRDB软件对差异microRNAs进行靶基因预测，GSEA数据库对靶基因进行GO及pathway功能富集分析研究1,25(OH)2D3对SKOV-3细胞中microRNAs表达的影响。结果：(1)1,25(OH)2D3明显抑制SKOV-3细胞增殖，并且存在着剂量-效应和时间-效应关系(P<0.01)。细胞周期分析显示，1,25(OH)2D3可以诱导SKOV-3细胞阻滞于G0/G1期，浓度越高阻滞越明显(P<0.05)。1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞核内DNA断裂点增加，细胞凋亡增多(P<0.05)。免疫荧光结果显示，1,25(OH)2D3促进β-catenin逐渐从细胞核中向细胞质中转移，浓度越高效果越明显；VDR在细胞核与细胞质均有表达，随着1,25(OH)2D3浓度的增加，细胞核内的VDR表达逐渐增加。Westernblotting定量发现，1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞中VDR的表达，抑制β-catenin、CCND1和FRAT1的表达，并且存在明显剂量反应关系(P<0.05)。(2)划痕实验及活细胞工作站均发现1,25(OH)2D3明显抑制SKOV-3细胞的迁移(P<0.05)。Westernblotting显示，1,25(OH)2D3促进SKOV-3细胞中E-cadherin表达量的增加、抑制Vimentin表达量的减少，并且存在剂量反应关系(P<0.05)。(3)单独TGF-β处理SKOV-3细胞后，细胞形态由细胞间连接紧密，呈椭圆形或多边形的上皮性细胞形态，变成散在生长，长梭形的间质细胞形态；SKOV-3细胞的迁移和运动能力增加；EMT转录因子Slug表达增加，上皮标志物E-cadherin表达降低，而间质标志物Vimentin表达增加，说明TGF-β能够成功诱导SKOV-3细胞发生EMT。划痕实验、活细胞工作站及Transwell实验从细胞的迁移、运动、侵袭三方面证实，1,25(OH)2D3能够抑制TGF-β诱导的卵巢癌细胞迁移作用；免疫荧光显示，对照组VDR受体主要表达于细胞浆中，VD组及VD+TGF-β组VDR受体向细胞核聚集。TGF-β促进Vimentin表达，抑制E-cadherin的表达，VD组则相反；VD+TGF-β组Vimentin表达水平低于TGF-β组，E-cadherin的表达则高于TGF-β组。TGF-β促进Slug、Snail和β-catenin向细胞核聚集，这一过程可以被1,2(OH)2D3抑制。Westernblotting定量分析蛋白表达，结果显示，TGF-β单独处理SKOV-3细胞，促进Vimentin和Slug的表达，抑制E-cadherin的表达，且在第一天作用最明显（P<0.05）。TGF-β对VDR表达没有影响，VD组与VD+TGF-β组VDR受体的表达水平很高，且VD+TGF-β组VDR受体的表达水平高于VD组(P<0.05)。TGF-β促进Slug、Snail、β-catenin和Vimentin的表达，抑制E-cadherin的表达，但这一过程能够1,25(OH)2D3阻止(P<0.05)。(4)microRNAs表达谱芯片结果显示，差异表达的microRNAs有8个，其中六个下调，分别是miR-1224-3p、miR-206、miR-4723-5p、miR-5194、miR-634和miR-644b-5p；两个上调，分别是miR-1260a和miR-1280。差异microRNAs中有4个与肿瘤发生相关的差异microRNAs，分别为miR-1280、miR-1224-3p、miR-206和miR-634。靶基因预测显示，总共预测靶基因2086个；靶基因功能富集发现，靶基因分别富集在受体活性、DNA结合、蛋白激酶活性、转入因子活性等分子功能上，细胞大分子代谢、蛋白代谢及修饰、细胞发育、信号转导等生物学过程上以及癌症、MAPK、Wnt、细胞粘附及细胞骨架等信号通路上。靶基因预测分析结果表明，microRNAs可能参与1,25(OH)2D3抑制SKOV-3细胞增殖和迁移所涉及的Wnt通路及EMT过程。结论：(1)1,25(OH)2D3抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖存在明显的剂量-效应和时间-效应关系，这与1,25(OH)2D3阻滞细胞周期于G0/G1期、诱导细胞凋亡、阻断Wnt/β-catenin信号通路有关。(2)1,25(OH)2D3抑制人卵巢癌细胞SKOV-3侵袭及迁移能力，这与1,25(OH)2D3下调Snail、Slug及β-catenin等促进EMT过程的转录因子和间质细胞标志物Vimentin的表达、上调上皮细胞标志物E-cadherin的表达有关，这些变化可以抑制EMT的发生。(3)分析1,25(OH)2D3处理人卵巢癌细胞SKOV-3差异表达的microRNAs，发现与肿瘤发生相关的差异microRNAs有miR-206、miR-1280、miR-634和miR-1224-3p，这些microRNAs可能参与1,25(OH)2D3抑制SKOV-3细胞增殖和迁移所涉及的Wnt通路及EMT过程。
【作者】高四海；
【导师】张增利；
【作者基本信息】苏州大学，卫生毒理，2014，硕士
【关键词】SKOV-3细胞；1,25(OH)2D3；增殖；迁移；EMT；

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