大肠杆菌表达型宿主中利用Duet兼容载体合成R-3-羟基丁酸

【摘要】R-3-羟基丁酸(R-3HB)是合成抗生素、生物聚酯、β-多肽等许多重要化合物的关键中间体。随着合成生物学的发展,生物合成R-3HB成为国内外研究热点。本研究在大肠杆菌表达型宿主中构建R-3HB的代谢途径,通过生物合成的方法获得R-3HB。首先克隆和活性表达R-3HB代谢途径中相关的酶基因。通过PCR扩增分别从大肠杆菌基因组、WautersiaeutrophaH16基因组获得tesB基因、phaAB基因簇,通过基因全合成获得ybgC基因。将tesB基因、ybgC基因构建在PET30a(+)上,获得重组质粒PT、PY,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,其酶活分别为221U/mL、4.32U/mL；将phaAB基因簇构建在pBluescriptSK(+)上,得到重组质粒PBHR69,并在大肠杆菌DH5a中得到了表达,phaA、phaB酶活分别为5.57U/mL、2.57U/mL。其次,为了实现phaA、phaB和硫酯酶三个基因的共表达,将它们分别构建在Duet兼容载体上。先将phaAB基因簇构建在ACYCDuet-1和RSFDuet-1载体上,通过蛋白电泳发现,ACYCDuet1对phaAB基因簇的表达效果更均衡。对于和第三个基因硫酯酶基因共表达时,发现相比于单质粒三基因共表达,将硫酯酶构建于RSFDuet-1载体上,双质粒共表达时,表达效果更好。然后比较了不同的质粒组合(ACYC+RSF)和(ACYC+PET30)的共表达效果及产物分析,发现(ACYC+RSF)的表达更均衡,产物量更高。然后比较了大肠杆菌硫酯酶tesB和外源硫酯酶ybgC对代谢途径的影响,发现当采用tesB作为水解酶时,产物量得到大幅提高,由此看出提高硫酯酶活可有效提高R-3HB产量。最后,将phaAB构建于ACYCDuet-1上,将tesB基因构建于RSFDuet-1上,产物R-3HB的产量得到进一步提高。本研究成功的在大肠杆菌表达型宿主中构建了R-3HB的代谢途径,得到的工程菌最高摇瓶产量可达到1.8g/L。
【作者】宋琳琳；
【导师】杨立荣；吴坚平；徐刚；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】R-3-羟基丁酸；表达型宿主；Duet兼容载体；共表达；硫酯酶；

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