生物肝素酶法合成途径中三种关键酶的克隆和表达

【摘要】肝素在体内外均有抗凝血作用,是目前最有效且应用范围最广的抗凝血类药物。体外酶催化合成生物工程肝素是目前肝素的研究重点。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcAc)和3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)分别是超低分子肝素(ULMWH)化学酶法合成途径中的糖基与硫磺基供体,价格昂贵因而无法应用于实际生产。以此为出发点,希望借助体外酶催化解决UDP-GlcAc和PAPS的来源问题,进而为ULMWH的大规模制备奠定物质基础。对于UDP-GlcAc,设计酶催化反应途径：在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UGD)的共同催化下,以尿苷三磷酸(UTP)和葡萄糖-1-磷酸(Gk-1-P)为起始底物,合成目标产物UDP-GlcAc;对于PAPS,在芳基硫磺基转移酶(ASTIV)的催化下,以PNPS为硫磺基供体再生PAPS。采用PCR从E.coliK12(MG1655)基因组中扩增得到UGPase和UGD的编码基因galU和ugd,对鼠源ASTIV的cDNA进行密码子优化并全合成;分别构建表达载体pET-28a(+)-galU,pET-28a(+)-ugd和pET-28a(+)-sratastⅣ;导入E.coliBL21(DE3)中诱导表达；亲和层析分离纯化目标蛋白,得到UGPase的纯度为97.4%,回收率为50.6%；UGD的纯度为93.2%,回收率为72.4%；ASTIV的纯度为95.3%,回收率为50.7%。对三个酶在大肠杆菌中的表达条件(包括诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时长)进行优化。最优条件下,UGPase的上清表达量为：0.67g/L,比酶活8.72U/mg;UGD的上清表达量为：0.71g/L,比酶活87.5mU/mg;ASTIV的上清表达量为80mg/L,比酶活42.5mU/mg。HPLC分析表明UGPase催化反应的底物转化率达到96.7%;UGPase和UGD双酶偶联反应的底物转化率为37.4%。进一步研究反应条件(包括缓冲液pH、温度、金属离子和离子强度)对UGPase和UGD催化活性的影响。用碱性磷酸酶(CIAP)对ASTIV构型转化,比酶活有效提高一倍,达到85.0mU/mg。本研究设计出一条UDP-GlcAc体外酶法合成途径并在大肠杆菌系统中实现鼠源ASTIV的重组表达与分离纯化。研究成果对于解决ULMWH酶法合成途径中原料来源问题具有理论指导意义和实际应用价值。
【作者】齐晨；
【导师】徐志南；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcAc)；3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)；尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UGD)；芳基硫磺基转移酶(ASTIV)；大肠杆菌；表达纯化；体外酶催化；

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