脂肪酶PaL和R-2-氯丙酸脱卤酶dehDIV-R的结晶及手性识别过程研究

【摘要】脂肪酶和脱卤酶是水解酶中重要的两大类。脂肪酶PaL能对四对外消旋薄荷醇丙酸酯进行选择性水解得到L-薄荷醇,脱卤酶dehDIV-R能对消旋2-氯丙酸进行选择性水解从而得到光学纯的S-2-氯丙酸,两酶均具有重要的应用前景。但目前其蛋白结构尚未确定,手性识别过程也不明确,对其进行结构解析和手性识别研究具有重要意义。首先利用已构建的重组菌(PaL菌株),可溶性表达脂肪酶PaL,并通过蛋白纯化条件的筛选,利用亲和镍柱、SuperdexTM75prepgrade凝胶柱和GEMiniSPC3.2/3阳离子交换柱等进行层析法纯化,得到高纯度的蛋白；然后利用座滴气相扩散法,在18℃和4℃C初筛得到蛋白单晶。对18℃初筛的晶体进行优化,最终在Tris-HCl(pH8.25),PEG400032%,0.3%蔗糖,0.2MNDSB-201条件下得到用于衍射的晶体。在结晶母液中添加10%的甘油作为冷冻保护液,在R-axisIV++(Rigaku)上收集数据,经HKL2000处理后分辨率截取在2.5A,每一个不对称单元含有两个蛋白分子,空间群为P21212。然后利用单波长反常散射法(Se-MAD)解决晶体结构解析中的相角问题。在培养基中完全用硒代甲硫氨酸代替甲硫氨酸培养细菌以产生含硒代甲硫氨酸的蛋白质,达到硒取代硫的目的,得到的硒代蛋白采用母体蛋白相同的纯化方式,再利用座滴气相扩散法,在4℃初筛得到蛋白单晶。对初筛的晶体进行优化,最终在PEG335024%,0.2M柠檬酸钾条件下得到质量较好的晶体。在上海同步辐射光源(SSRF)的B17U线站上收集数据。经HKL2000处理后截取的分辨率为2.3A(图2.17),每一个不对称单元含有两个蛋白分子,空间群仍然是P21212。但遗憾的是从HKL2000处理结果中未观察到Se的反常散射信号。接着本文利用已构建的重组菌(dehDIV-R菌株),可溶性表达脱卤酶dehDIV-R,并通过蛋白纯化条件的筛选,利用亲和镍柱、SuperdexTM75prepgrade凝胶柱和GEMiniQPC3.2/3阴离子交换柱等纯化手段,得到高纯度的蛋白；然后在4℃下利用座滴气相扩散法进行初筛晶体,优化后在0.1MBis-Trispropane(pH8.5),20%PEG3350,0.2M氟化钠条件下晶体质量有所改善。最后以dehDIV-R为模型,研究了R-2-卤代酸脱卤酶的手性识别过程。首先通过测定反应产物的构型,确定dehDIV-R催化底物为SN2反应。通过DiscoveryStudio3.0对dehDIV-R进行同源模建及底物分子对接,得到dehDIV-R立体选择性的关键位点Asn236,预测dehDIV-R的立体选择性与反应时底物到达反应位置的空间位阻密切相关,并利用后续突变实验证明了模型的合理性。
【作者】张滢潭；
【导师】吴坚平；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】R-2-氯丙酸脱卤酶；脂肪酶；结晶；分子模拟；

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