利用TALENs技术制备MSTN基因敲除的阿尔巴斯绒山羊

【摘要】肌肉生成抑制素（Myostatin,MSTN）是骨骼肌生长发育的一个重要的负调控因子,是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的成员之一,具有抑制肌肉分化和生长的作用。研究表明通过遗传操作降低MSTN基因的表达能加速肌肉生长并增加产肉量。本研究首先构建了针对MSTN基因的TALENs载体,并利用标记蛋白表达载体优化了绒山羊胎儿成纤维细胞的脂质体共转染条件,然后利用最优的转染条件将TALENs载体导入阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞中,挑取转染后的单个细胞培养,建立单克隆细胞系,通过PCR鉴定筛选出MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞系。选择MSTN-/-基因型的细胞通过体细胞核移植（Somaticcellnucleartransfer,SCNT）的方法制备胚胎,移植受体后生产基因敲除的绒山羊。1、绒山羊胎儿成纤维细胞共转染条件的优化利用脂质体法将红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed质粒和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1质粒共同导入绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选最优的转染条件。在转染48h后,倒置荧光显微镜下可以观察到大量表达红色荧光和绿色荧光的阳性细胞并且细胞生长状态良好。通过流式细胞仪进行分析,发现最高的共转染率为24.5%。对应的最优共转染条件为：每1×105个绒山羊胎儿成纤维细胞加入脂质体3μL,pCMV-DsRed和pEGFP-C1的质粒量各250ng。2、利用TALENs技术制备MSTN基因敲除绒山羊胎儿成纤维细胞本实验采用“单元组装法”通过酶切连接将四单元模块和三单元模块进行拼接,成功构建出一对TALENs载体。采用最适的转染条件,将TALENs载体bMK（包括S1586-PEASS、1586-PERR两个质粒）导入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中,随机挑取单个细胞培养,建立单克隆细胞系。设计横跨打靶位点的引物对每个单克隆细胞系的基因组进行PCR扩增,并对PCR产物进行测序,筛选出靶位点发生突变的单克隆细胞系。本研究共进行了三次打靶实验,共获得160个单克隆细胞系,其中有20个单等位基因敲除和3个双等位基因敲除的阳性单克隆细胞系,总敲除效率为14.38%。选取其中一株双等位基因敲除细胞系D4进行染色体数目分析,检测正常率为90%（27/30）。本研究选择D4细胞系作为供体细胞通过体细胞核移植的方法生产MSTN基因敲除绒山羊。3.MSTN基因敲除绒山羊的生产取屠宰山羊卵巢,切割法采卵,体外培养18h,利用盲吸法去除卵母细胞的细胞核,分别将MSTN-/-型和WT型细胞系作为供体细胞移入去核的卵母细胞中,融合、激活后进行体外发育培养。我们采用电融合法进行融合,融合率分别为74.59%、71.2%；用IA23187和6-DMAP进行融合卵的激活,用发育液进行体外培养,48h后统计卵裂率分别为65.54%、65.9%。本研究通过体细胞核移植技术共获得738枚MSTN-/-型重构胚胎和723枚WT型重构胚胎。将其中363枚卵裂的MSTN-/-克隆胚胎通过手术法移植入自然发情第三天的84只受体母羊的输卵管中。移植2个月后妊娠检测,有7只未返情母羊怀孕,妊娠率为4.76%。
【作者】杨文亮；
【导师】仓明；
【作者基本信息】内蒙古大学，动物学，2014，硕士
【关键词】肌肉生长抑制素；基因敲除；TALENs；体细胞核移植；

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