纳米硒的体内外生物效应研究

【摘要】硒是人类和动物所必需的微量元素,以硒代半胱氨酸的形式位于多种硒蛋白的催化部位发挥其生理作用,但其营养范围很窄,过量摄入会对生物产生一定的毒性。而纳米硒作为一种有别于普通无机硒和有机硒的新型硒形式,因其特殊的理化特性而受到广泛关注,但是目前关于纳米硒生物学效应的研究结果各异,相关代谢作用机制仍没有完全清楚。体外Caco-2细胞模型和模式动物斑马鱼已被广泛用以营养物质的代谢和生物学效应研究。鉴于此,本文运用Caco-2细胞体外模型和蛋白组学技术比较研究了纳米硒相较于其它形式硒(Se-Met和Na2SeO3)在细胞中的代谢差异,运用斑马鱼模式生物进行体内纳米硒的急性毒性研究,旨在深入探究纳米硒相对于普通无机硒和有机硒的独特生物学效应及其产生机制,为纳米硒的应用奠定一定理论基础。主要研究结果如下：1、结合粒径分析技术,探究了制备不同粒径纳米硒的不同方法。运用多糖模板法制备得到了平均粒径在130m左右的纳米硒粒子,运用蛋白质模板法制备得到了平均粒径分别在25nm、40nm和80nm左右的纳米硒粒子,后续实验采用了蛋白质模板法制备纳米硒。2、建立Caco-2细胞模型进行了三种形式硒(Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3)在模型中的转运和摄取试验。37℃C下,相同浓度(0.1μmol/L)的三种形式硒在模型中的转运和摄取在AP-BL和BL-AP两个方向上都是呈现时间(2h内)依赖。到2h为止,Caco-2细胞对Nano-Se和Se-Met的转运率(分别为9.11±3.09%和7.33±2.36%)要显著高于Na2Se03(1.84±0.64%)(P<0.05),而Nano-Se和Se-Met之间的差异不显著；同时,Caco-2细胞对Nano-Se的摄取率(8.36±1.70%)显著高于Se-Met(4.75±0.41%)和Na2Se03(0.99±0.14%)(P<0.05),且Se-Met和Na2Se03之间也是差异显著的(P<0.05)。在37℃C下,Na2SeO3跨Caco-2细胞单层的表观通透系数Papp(AP-BL和BL-AP)都要显著小于其他两种形式的硒(P<0.05),而Nano-Se和Se-Met之间没有显著差异,且所有的Papp(AP-BL)/Papp(BL-AP)(R)都处在0.99-1.06之间,没有显著差异。3、结合双向电泳技术和质谱分析研究了不同形式硒(Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3)处理前后Caco-2细胞的蛋白质组差异,经过PDQuest软件分析得到了30个差异显著的差异蛋白质点,经质谱分析鉴定得到了7个涉及细胞生长发育、能量代谢、抗氧化性能等方面的有生物学意义的差异蛋白,分别为磷酸丙酮异构酶(TSPisomerase)、T-复杂的蛋白质1亚基ζ(TCPZ).核纤层蛋白B1(Lamin-B1)、异质核核糖核蛋白F(hnRNPF)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Cu,Zn-SOD)、泛素结合酶E2K(E2K)和谷胱甘肽合成酶(GS)。按对照、亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒的顺序,TSPisomerase、TCPZ、Lamin-B1、hnRNPF和Cu,Zn-SOD的表达具有不同程度的下调趋势,而E2K和GS的表达具有不同程度的上调趋势,并且除E2K外,纳米硒对其它蛋白的表达调控呈现与硒代蛋氨酸相似的作用效果。4、以硒代蛋氨酸为参比,进行了纳米硒对斑马鱼胚胎的毒性研究,得到了纳米硒对斑马鱼胚胎具有致畸效应,不同浓度硒溶液暴露会使斑马鱼胚胎产生包括体轴弯曲(AM)、心包水肿(PE)、卵黄囊水肿(YES)、游囊膨胀不全(USB)、死亡等典型畸型。随着硒浓度及作用时间的增加,纳米硒和硒代蛋氨酸诱导斑马鱼死亡的胚胎数以及畸形的胚胎数都呈现增加趋势,通过计算得出纳米硒在96hpf的LC50为7.18μmol/L,在120hpf的LC50为5.68μmol/L;DL-硒代蛋氨酸在96hpf的LC50为67.32μmol/L,在120hpf的LC50为54.66μmol/L。此外,在120hpf时纳米硒的TC50为3.27μmol/L,而DL-硒代蛋氨酸的TC50为44.22μmol/L。5、选用几种关键酶作为分子指标研究了不同浓度纳米硒对其活力的影响。纳米硒暴露下,按照0μmol/L、2μmol/L、6μmol/L的顺序,斑马鱼胚胎的碱性磷酸酶(AKP)活力呈现下降趋势,并且三组之间差异显著(P<0.05)；同时,酸性磷酸酶(ACP)和Na+K+-ATPase活力也呈现略微的下降趋势,但三组之间差异不显著(P>0.05)；谷胱甘肽-S转移酶(GST)活力是0μmol/L和2μmol/L组相似,而6μmol/L组明显升高,并且与0和2μmol/L组相比是差异显著的(P<0.05)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力是2μmol/L组比0μmol/L要大,而6μmol/L组又比2μmol/L组小,并且三组之间相比是差异显著的(P<0.05)。几种酶活力变化表明纳米硒影响斑马鱼胚胎的生长代谢、解毒能力以及抗氧化能力等。
【作者】严旭霞；
【导师】王彦波；
【作者基本信息】浙江工商大学，食品科学与工程，2013，硕士
【关键词】纳米硒；Caco-2细胞；斑马鱼；双向电泳；生物效应；

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