菲降解菌株的分离、特性研究及其在植物—微生物联合修复重金属—菲复合污染土壤中的初步应用

【摘要】从江苏省射阳县某化工厂废水处理池的活性污泥中分离到两株菲降解菌株,分别命名为PHE-1和PHE-2,根据其形态特征、生理生化特性和16SrRNA基因相似性分析,将PHE-1鉴定为鞘酯菌属(Sphingobiumsp.),将PHE-2鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.)。两株菌均在pH6.0-9.0范围生长良好,最适生长pH分别为7.0和8.0,最适生长温度均为30℃。在以100mg/L菲为唯一碳源的无机盐培养基中,PHE-1和PHE-2在18h内对菲降解率分别为99.12%和99.56%。Cu2+浓度高于800mg/L,Cd2+浓度高于450mg/L会明显抑制PHE-1对菲的降解,Cu2+浓度高于400mg/L,Cd2+浓度高于1000mg/L会明显抑制PH.E-2对菲的降解。对菌株PHE-2的菌落形态进行观察发现,在高于300mg/L的Cd2+胁迫下,PHE-2菌落边缘出现透明化,内部出现絮状沉淀,初步推测可能是其对Cd2+毒害的一种耐性反应。多环芳烃芳香环双加氧酶是菲降解途径中第一个酶,它决定降解反应的起始。我们根据已报道的多环芳烃双加氧酶α亚基基因(ahdA1b)设计引物从菌株PHE-1中克隆到长度为1.49kb的基因片段。测序结果表明,与Sphingomonassp.ZP1(EU082776)、Sphingomonassp.P2(AB091693)的ahdA1b的相似性分别为99%、97%。其它与ahdA1b相似度较高的菌株大多数都来自鞘酯菌科(Sphingomonadaceae),显示该基因在鞘酯菌科菌株中具有很强的保守性。通过SEFA-PCR的方法获得了该基因片段上下游片段,拼接后的总长为9.1kb。Blast在线比对分析结果显示其与Sphingomonassp.P2芳香环化合物降解基因簇(GenBankAccessionNo.AB091693)的相似性为96%,它包含六个基因分别为xylA,xylM,ahdA2b,ahdA1b,ahdA2a和ahdA1a。邻苯二酚双加氧酶是菲降解过程中另外一个关键酶,它催化中间代谢产物的开环。根据已报道的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(xylE)设计引物,从PHE-1中扩增该基因。结果显示,从PHE-1中克隆得到xylE基因(1188bp),在线序列相似性比对显示,该基因与Sphingomonassp.B2-7中xylE(EU596533.2)的相似性为99%。采用荧光定量PCR技术,研究了菲、Cd2+、Cu2+对菌株PHE-1中邻苯二酚-2.3-双加氧酶基因(xylE)和多环芳烃双加氧酶a亚基基因(ahdA1b)转录的影响,结果显示ahdAlb基因和xylE基因均为诱导型基因,菲诱导下ahdA1b基因的拷贝数要远高于xylE基因的拷贝数；在低浓度Cd2+、Cu2+(100mg/L)胁迫下xylE和ahdA1b的拷贝数高于对照中相对应基因的拷贝数。在500mg/LCd2+胁迫下,xylE和ahdA1b的拷贝数低于对照中相对应基因的拷贝数,在500mg/LCu2+胁迫下,xylE和ahdA1b的拷贝数高于对照中相对应基因的拷贝数。利用黑麦草分别与PHE-1,PHE-2菌株建立植物-微生物联合修复体系,分别对浓度为500mg/kg菲单一污染土壤、铜-菲复合污染土壤(菲和Cu2+浓度均为500mg/kg)以及电子垃圾土进行生物修复实验。每克土壤中接种菌株1.5×107个,结果显示,植物-微生物联合修复的效果明显优于微生物单独修复的效果。在菲单一污染土壤中,接种PHE-1的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为101.9mg/kg.116.1mg/kg)和接种PHE-2的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为86.9mg/kg.90.6mg/kg)均低于未接种功能菌株的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为150.3mg/kg.204.1mg/kg);接种PHE-1的土壤中xylE基因的平均拷贝数(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为5.18×108copies/g.3.23×108copies/g)和接种PHE-2的土壤中xylE基因的拷贝数(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为1.285×109copies/g.6.98×108copies/g)高于未接种功能菌株的土壤中xylE基因的拷贝数(种植黑麦草、未种植黑麦草分别为1.64×108copies/g和1.31×108copies/g)。在铜-菲复合污染土壤中,接种PHE-1的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为101.2mg/kg、115.7mg/kg)和接种PHE-2的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为140.8mg/kg、140.1mg/kg)均低于未接种功能菌株的土壤中的菲残留浓度(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为152.3mg/kg、204.2mg/kg);接种PHE-1的土壤中xylE基因的平均拷贝数(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为1.98×109copies/g、6.24×108copies/g)和接种PHE-2的土壤中xylE基因的拷贝数(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为7.27×108copies/g、4.01×108copies/g)高于未接种功能菌株的土壤中xylE基因的拷贝数(种植黑麦草和未种植黑麦草分别为2.1×108copies/g、1.08×108copies/g)。在电子垃圾土中,接种功能菌株土壤中与未接种功能菌株盆钵中土壤中菲残留浓度以及xylE基因的拷贝数没有明显差异。对比铜-菲复合污染土壤的实验结果,发现接种PHE-1的盆钵中的菌株降解效果要好于接种PHE-2的盆钵中菌株降解效果。本研究分离到两株具有重金属耐性的菲降解菌株,研究了其生物学特性和降解特性,并将它们初步应用于植物-微生物联合修复菲-重金属复合污染土壤。为有机物和重金属复合污染环境的生物修复提供了一定的理论基础和技术支撑。
【作者】杨莹；
【导师】沈振国；洪青；
【作者基本信息】南京农业大学，植物学，2013，硕士
【关键词】菲；生物降解；基因克隆；重金属-菲复合污染；植物-微生物联合修复；

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