两个棉纤维发育相关基因GhFBP和GhVIN2的克隆与功能分析

【摘要】棉花是我国重要的经济作物之一,棉纤维作为重要的纺织原料,对我国经济的发展起着积极的促进作用。棉纤维是由棉花胚珠的外表皮细胞分化发育而来,具有吸湿、透气性好、价廉等优势,越来越受到人们的关注,有关纤维发育的研究日益增多。但是纤维发育过程极其复杂,有大量的代谢途径为其提供物质基础,并有上千个基因参与纤维形态的建立。纤维突变体材料是研究纤维发育相关过程的理想材料,将突变体材料与正常材料进行各个水平的比较分析,可以帮助我们更好的阐述纤维发育的相关机制。因此,利用突变体材料研究纤维发育相关基因的特征及功能分析,可以更好地揭示纤维发育各个过程的分子机制,对优异基因的发掘、改良纤维品质等具有重要的意义。本研究主要从纤维不成熟突变体im和遗传标准系TM-1的竞争杂交芯片中选取纤维发育过程中表达差异显著的基因：果糖-1,6-二磷酸酯酶(GhFBP)和液泡转化酶2(GhVIN2),对其开展克隆、结构及功能初步分析。具体研究结果如下：1.GhFBP的克隆及功能分析GhFBP是蔗糖代谢途径中重要的限速酶,可将果糖-1,6-二磷酸分解为无机磷和6-磷酸果糖,后者是生物合成途径中的必需己糖。本文选择im和TM-1纤维发育时期的芯片竞争杂交得到的一个显著差异表达的EST序列,通过电子拼接,并结合RT-PCR技术,成功克隆了一个棉花中的GhFBP的cDNA和基因组序列,ORF全长为1026bp,编码341个氨基酸,等电点为5.86,分子量为37.15kD；该基因包含12个外显子和11个内含子。序列进化分析显示在四倍体棉种中,该基因有2个拷贝,与二倍体祖先供体种相比,该基因的同源物其A组与A亚组和D组与D亚组分别聚在一起,在四倍体棉种中独立进化。利用SNP技术将该基因的一个拷贝定位在四倍体棉种D2染色体上。运用Q-PCR对该基因在两个材料中的不同组织器官进行表达分析,发现该基因属于纤维优势表达基因,特别在纤维次生壁加厚期,基因表达迅速增高。比较TM-1和im纤维发育在16DPA-22DPA期间的表达特征,发现该基因在TM-1中的表达水平显著高于在im中的表达,结合前人运用高效液相色谱技术对TM-1和im不同纤维发育期的纤维蔗糖含量测定结果,发现该基因的表达差异与蔗糖差异正相关,推测该基因功能与纤维次生壁加厚过程中的蔗糖合成有关。2.GhVIN2的表达及功能分析GhVIN2在植物液泡中不可逆地催化蔗糖裂解为果糖和葡萄糖,调节液泡渗透压,进而影响纤维细胞膨压,促进纤维细胞伸长。本文选择im和TM-1纤维发育时期的芯片竞争杂交得到的一个显著差异表达的EST序列为探针,进行电子搜寻,在NCBI发现GhVIN2同源基因,序列相似性99%,进一步设计该基因专化引物,成功克隆出该基因的cDNA和基因组序列。GhVIN2的ORF全长为1587bp,编码618个氨基酸；等电点为5.25,分子量为69.KD。序列进化分析显示在四倍体棉种中,该基因有2个拷贝,与二倍体祖先供体种相比,该基因的同源物其A组与A亚组和D组与D亚组分别聚在一起,在四倍体棉种中独立进化。利用SNP技术将该基因的一个拷贝定位于四倍体棉种A3染色体上。运用Q-PCR对该基因在两个材料中的不同棉组织器官进行表达分析,发现该基因在花药中表达最高,在纤维中优势表达,其中13DPA纤维中基因表达最高,随后表达呈下降趋势,其中在13DPA-19DPA期间,发现该基因在TM-1中的表达水平显著高于在im中的表达。利用本实验室配置的im和CSIL28F2/F2：3分离群体,结合其不同世代检测的纤维品质数据,通过标记关联分析,检测到该基因与纤维强度存在极显著相关,说明该基因在棉纤维伸长及次生壁合成过程中扮演重要角色。
【作者】徐文亭；
【导师】郭旺珍；
【作者基本信息】南京农业大学，作物遗传育种，2013，硕士
【关键词】棉花；纤维发育；果糖-1,6-二磷酸酯酶；液泡转化酶2；表达分析；

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