猪链球菌2型新型溶血相关基因鉴定及功能研究

【摘要】猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原,能引起猪脑膜炎、败血症、关节炎等多种病症。在33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcussuistype2,SS2)流行最广、毒力最强。近年来,SS2引起的猪链球菌病在我国有两次暴发流行,造成巨大经济损失,带来严重公共卫生问题。尽管已报道了多种该菌的毒力因子,其致病机理仍不清晰。本研究以SS2新型溶血相关基因Hhly3为研究对象,通过构建基因缺失突变株,比较生物学特性,研究Hhly3在SS2致病过程中的作用。研究结果丰富了对该菌致病机理的认识。1、猪链球菌2型新型溶血相关基因分布及蛋白定位我国近两次流行的SS2菌株有89KPAI这一重要毒力标志。Hhly3基因是通过差减抑制杂交筛选到的位于89KPAI上的SS2可能毒力基因。本实验通过基因序列分析,克隆表达,基因分布检测,蛋白定位检测等方法鉴定Hhly3基因。实验结果表明：Hhly3基因编码78kDa蛋白,含有8段跨膜结构,与溶血素Ⅲ型超家族有共同的保守区域。待检31株S.suis菌株中,Hhly3主要存在于SS2中国强毒分离株,基因分布情况与89KPAI分布情况一致。此外Westernblot证实其编码具有良好免疫原性的细胞膜蛋白,为假定四型分泌系统重要通道蛋白。2、猪链球菌2型Hhly3基因缺失株的构建及生物学特性分析为了进一步研究Hhly3基因在SS2致病过程中的作用,利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除SS2ZY05719的Hhly3基因,构建了Hhly3基因缺失株ΔHhly3,并构建互补株CΔGhly3作为对照。实验结果表明Hhly3编码蛋白具有溶血性活性,与野毒株比较,Hyly3缺失导致SS2溶血活性显著降低(尸<0.01)。作为假定通道蛋白,HHLY3的缺失使sly表达下降76%,导致SS2上清溶血性大幅下降,SS2细胞毒性降低。此外,系列实验显示ΔHhly3在全血存活、酸碱耐受、粘附上皮细胞、生物被膜形成以及毒力因子表达等方面能力显著降低(P<0.05)。对斑马鱼致病力,△Hhly3(LD50=1.30×106CFU)显著弱于野毒株(LD50=2.39×105CFU).综上所述,Hhly3基因作为新型外源毒力因子在SS2溶血、定植及感染方面发挥重要作用。3.Hhly3-ref双基因缺失株的构建及特性分析假定转录调节因子ref以及溶血相关基因Hhly3均是通过SSH筛选位于SS2Tn916上的差异基因,ref基因是否对溶血功能具有协同调控作用尚不明确。本实验通过构建ΔHhly3/ref双基因缺失突变株研究ref基因功能。结果表明,与单基因缺失株ΔHhly3对比,ΔHhly3/ref在多个生物学特性方面变化不显著。此外,与野毒株相比,ΔHhly3/ref与ΔHhly3四环素敏感性升高,qRT-PCR检测显示ref缺失并未导致ΔHhly3中位于Tn916上的四环素耐药基因tet(M)表达发生显著变化(P>0.05)。因此ref矿基因功能有待进一步研究发现。
【作者】郑君希；
【导师】范红结；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪链球菌2型；Hhly3；基因敲除；89K毒力岛；

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