长链非编码RNA在急性放射性肺损伤中的作用及机制的初步研究

【摘要】目的：采用高通量长链非编码RNA(LongnoncodingRNAs，LncRNAs)芯片筛选可能与放射性肺损伤相关的lncRNAs，初步在体外探讨lncRNA对放射性肺损伤发生的影响及相关机制。方法：(1)5~6周龄雌性C57BL/6小鼠共24只，分为照射组和对照组，每组12只。经12Gy6-MeVX射线直线加速器进行全胸照射，剂量率200cGy/min，源皮距100cm。照射后24h取右半肺经甲醛固定、石蜡包埋后进行免疫组化检测磷酸化-H2AX表达。左半肺则经RNA提取、纯化、标记后进行小鼠LncRNA基因芯片检测。杂交信号经生物信息学分析获得放射性肺损伤早期差异表达的lncRNAs。相关lncRNAs最后经RealtimePCR进行验证，并进一步进行生物信息学分析。(2)选取经验证和分析后的一种lncRNA，设计合成相应siRNA干扰细胞中该lncRNA的转录。采用克隆形成实验检测lncRNA敲减对肺上皮细胞Beas-2B细胞增殖能力的影响，通过流式细胞术分析lncRNA转录抑制对Beas-2B细胞周期分布及凋亡的影响。经磷酸化γ-H2AX免疫荧光染色法检测抑制该lncRNA对Beas-2B细胞中由电离辐射引起的DNA损伤情况。通过Westernblot法初步确定抑制该lncRNA对肺上皮细胞电离辐射后细胞周期相关蛋白及DNA损伤修复相关蛋白表达的调控。结果：(1)免疫组化分析发现照射组小鼠肺组织中磷酸化-H2AX表达显著增加（P<0.05）。经基因芯片筛选出放射性肺损伤早期304种差异表达的lncRNAs，其中62种表达上调，242种表达下调；有9种差异表达的lncRNAs位于编码基因附近（＜300bp）。同时筛选出了97种高表达和463种低表达的mRNA，GO分析这些mRNA主要集中在应激反应，免疫调节等相关通路，pathway分析发现参与P53信号、新陈代谢等信号调节通路。最后在放射性肺损伤早期肺组织中经RealtimePCR验证了位于编码基因附近的6种差异表达lncRNAs。经生物信息学分析，选取其中1种受照后显著上调的lncRNA进行后续功能研究。(2)成功构建lncRNA低表达的Beas-2B细胞稳定株。lncRNA低表达可显著增加Beas-2B细胞的增殖速率，并引起Beas-2B细胞发生明显的G2期阻滞。减少电离辐射引起的γ-H2AXfoci的数目。Westernblot检测发现lncRNA低表达后Beas-2B细胞中周期相关RAD50、磷酸化P53和RB蛋白表达水平明显减少，而KU70、KU80、MDM2、CDK2的表达水平明显增加。结论：12Gy全胸X射线照射24h后即可引起小鼠肺组织DNA损伤，并引起肺组织中lncRNAs的差异表达。lncRNA在体外参与对人支气管上皮细胞增殖及放射敏感性的调控，其作用机制可能与其对细胞周期、DNA损伤修复等相关蛋白的表达调控有关，然而具体的作用途径和分子机制还有待进一步的深入研究。
【作者】刘畅；
【导师】焦旸；
【作者基本信息】苏州大学，放射医学，2014，硕士
【关键词】放射性肺损伤；长链非编码RNA；RNA干扰；放射敏感性；细胞周期；DNA损伤；磷酸化P53；

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